朱麗華,蔣翠花,張 健,張現(xiàn)濤,殷志琦

(1.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制劑系,南京 211198;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室,南京 210028;3.南京海鯨藥業(yè)有限公司,南京 210031)

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄不足所導(dǎo)致體內(nèi)尿酸升高的代謝紊亂疾病,已成為繼高血壓、高血糖、高血脂之后的第四大健康風(fēng)險因素,即常說的“第四高”[1]。 隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變、人口老齡化及肥胖的流行,高尿酸血癥在世界各地的發(fā)病率和患病率均呈逐漸上升趨勢[2]。 近年,中國沿海地區(qū)和發(fā)達(dá)城市高尿酸血癥發(fā)病率已高達(dá)25%,且呈年輕化趨勢[3-4]。持續(xù)高尿酸可引發(fā)腎衰或痛風(fēng),也會促進(jìn)肥胖、代謝綜合征、脂肪肝和糖尿病等代謝疾病的發(fā)生發(fā)展[5],危害人類健康。

高效、穩(wěn)定的高尿酸血癥動物模型是防治高尿酸血癥藥物研究的重要基礎(chǔ)。 目前主要是通過增加體內(nèi)尿酸來源(如腺嘌呤、酵母)、減少腎對尿酸排泄(如乙胺丁醇)、抑制尿酸氧化酶活性(如氧嗪酸鉀)、基因改造(如敲除ABCG2)等方式進(jìn)行藥物單獨或聯(lián)合造模來構(gòu)建高尿酸血癥模型[6]。 但這些造模方法評價標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,穩(wěn)定性差,并伴隨不同程度腎損傷[7]。 此外,同一造模方法在不同實驗環(huán)境、實驗條件等因素影響下,效果也會有所不同,因此至今國內(nèi)外尚無公認(rèn)、統(tǒng)一的高尿酸血癥模型。

因此,本研究將氧嗪酸鉀、果糖、次黃嘌呤3 種造模劑單用或聯(lián)合造模,在不同的造模時間、造模方式下建立大鼠高尿酸血癥模型,通過觀測大鼠的血尿酸、肌酐、尿素氮水平、AST、ALT 和 XO 活力、肝腎病理切片、腎ABCG2 蛋白表達(dá)的變化情況,評價各種造模的優(yōu)劣勢,以期為高尿酸血癥模型的合理建立和應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性 SPF 級 Sprague-Dawley 大鼠 85 只,體重220~240 g,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005]。 大鼠飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院SPF 級實驗動物中心[SYXK(蘇)2016-0018],飼養(yǎng)溫度為(24±2)℃,相對濕度(60±10)%,采用12 h:14 h 晝夜間斷照明,動物自由進(jìn)食和飲水。 動物實驗方案通過江蘇省中醫(yī)藥研究院的實驗動物使用與管理委員會審批(AEWC-20180724-40),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀(YQ34L-LA)購于東京化成工業(yè)株式會社;果糖(J01J10R89818)購于上海源葉生物科技有限公司;次黃嘌呤(G1725018)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;尿酸試劑盒(20190812)、肌酐試劑盒(20191104)、尿素氮試劑盒(20191104)、XO 試劑盒(20190902)、ALT 試劑盒(20200928)、AST 試劑盒(20200927)均購于南京建成生物工程研究所;羧甲基纖維素鈉(C1814029)購于阿拉丁公司;BCA 蛋白定量檢測試劑盒(120219200601)、PMSF(ST506)、RIPA 裂解液(P0013B)、HRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG(AO208)、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒( 071119200611 )、 Buffering 上 樣 緩 沖 液(042220200929)均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗 ABCG2 抗體(L10123192)、兔抗 β-actin抗體(I11181372)均購于沈陽萬類生物科技有限公司;蘇木素-伊紅染液(KGA224)購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

MS205DU 電子分析天平(瑞士Mettler Tolerdo公司);Allera64R 低溫高速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司);SynergyH1 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國伯騰儀器有限公司);Axlo VertA1 倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss 公司);164-5052 Western 電泳儀(美國Bio-Rad 公司);Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore Corporation 公司);SPE10-0111 apphire 雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)(美國AZURE 公司);Sceint2-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司);690BR028786 轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑的配制

稱量羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)樣品5.000 g,加入 1000 mL 蒸餾水,配制 0.5% CMC-Na 溶液。 以CMC-Na 溶液做溶媒,分別配制10 mg/mL、30 mg/mL 的氧嗪酸鉀混懸液,10 mg/mL 的次黃嘌呤混懸液。 采用蒸餾水配制5%的果糖無色透明溶液。 將配置好的溶液置于4℃冰箱儲存。

1.3.2 動物分組與造模方式

SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,大鼠隨機分為方法1~方法7 各組,包括正常組和模型組,每組6 只大鼠,為排除其他因素的影響,在同等條件下,正常組給予0.5% CMC-Na 來替代造模劑,各種高尿酸大鼠模型組具體制備方法見表1。 實驗期間,實驗大鼠自由飲水和攝食。

表1 高尿酸血癥大鼠模型方法制備Table 1 Preparation of rat model of hyperuricemia

1.3.3 樣品的收集和處理

取血前禁食不禁水12 h,氧嗪酸鉀末次造模后1 h 時取血。 血樣室溫下靜置 1 h 后,3500 r/min 離心15 min,收集上清液,置于-80℃條件下保存。

1.3.4 生化指標(biāo)的測定

按試劑盒說明書測定大鼠血清的尿酸、肌酐、尿素氮含量、AST、ALT 和 XO 活性。

1.3.5 肝腎組織病理學(xué)觀察

實驗結(jié)束后安樂處死大鼠,快速剝離肝腎組織,生理鹽水沖洗干凈,置于10%福爾馬林液48 h。然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色等操作,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 蛋白印跡分析

準(zhǔn)確稱取100 mg 腎皮質(zhì)組織,加入含蛋白酶抑制劑 PMSF 的 RIPA 裂解液1 mL 進(jìn)行組織勻漿,4℃,12000 r/min 離心 10 min,收集上清液,采用BCA 蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度。 將蛋白質(zhì)樣品和上樣緩沖液以4 ∶1的比例混合并煮沸5 min 后,將混合物在10% SDS-PAGE 電泳凝膠中分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,將膜置于5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,然后用ABCG2 抗體4℃孵育過夜。 第2 天將膜取出,用TBS-Tween 洗滌3 次,每次5 min,加入二抗室溫孵育 1 h,TBS-Tween 洗滌 3 次,每次5 min。 蛋白印跡成像系統(tǒng)對膜成像,Image J 軟件進(jìn)行光密度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPade7 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組試驗組間比較采用T檢驗法分析,多個試驗組間比較采用單因素方差A(yù)NOVA 法分析,P<0.05 視為統(tǒng)計學(xué)上有差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 血清尿酸、肌酐、尿素氮的變化情況

如表2 所示,單次使用氧嗪酸鉀造模,方法1 和方法2 均可使血尿酸含量顯著性升高(P<0.01),且方法1 效果更優(yōu)。 但兩個方法中模型大鼠的血肌酐和血尿素氮水平相較于正常組無顯著變化(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮的變化情況()Table 2 Changes of serum uric acid, creatinine, urea nitrogen in each group of rats

表2 各組大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮的變化情況()Table 2 Changes of serum uric acid, creatinine, urea nitrogen in each group of rats

注:各方法的模型組與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01。Note. Comparison of model group with normal group for each method, #P<0.05, ##P<0.01.

方法分類Method classification組別Groups血清尿酸(μmol/L)Serum uric acid肌酐(μmol/L)Creatinine尿素氮(mmol/L)Urea nitrogen方法1 Method 1方法2 Method 2方法3 Method 3方法4 Method 4方法5 Method 5方法6 Method 6方法7 Method 7正常組 Normal group 100.8±30.1 45.4±8.1 4.4±0.2模型組 Model group 201.7±12.1## 46.8±8.0 4.5±0.2正常組 Normal group 85.5±25.5 45.4±11.8 4.6±0.3模型組 Model group 206.0±54.8## 46.8±13.8 4.5±0.4正常組 Normal group 144.5±28.0 12.2±5.6 4.7±1.4模型組 Model group 211.5±23.1## 14.2±8.1 3.7±1.4正常組 Normal group 84.8±11.5 69.2±10.6 4.3±0.2模型組 Model group 268.4±36.6## 65.3±7.8 5.5±0.8#正常組 Normal group 195.8±11.1 130.9±13.9 4.4±0.3模型組 Model group 678.7±30.5## 162.8±27.8# 7.8±1.2##正常組 Normal group 121.2±31.5 14.9±3.1 3.8±0.9模型組 Model group 208.2±64.0## 11.2±1.9 5.4±0.7#正常組 Normal group 191.4±19.3 45.2±8.5 3.7±0.8模型組 Model group 267.5±30.1## 40.9±8.2 5.5±1.5#

連續(xù)7 d 用氧嗪酸鉀單獨造模或聯(lián)合造模后,與各方法中正常組相比,方法3 中模型組大鼠的血清尿酸顯著升高(P<0.05),而肌酐和尿素氮無顯著性差異(P>0.05)。 方法4 中模型組大鼠血清尿酸(P<0.01)和尿素氮含量顯著增高(P<0.05),而肌酐無顯著性差異(P>0.05)。 方法5 模型組大鼠血清尿酸(P<0.01)、肌酐和尿素氮水平均顯著性上升(P<0.05)。

連續(xù)14 d 用氧嗪酸鉀單獨造?；蚵?lián)合造模后,與各方法中正常組相比,方法6 模型組大鼠的血清尿酸和尿素氮水平顯著性升高(P<0.05),而肌酐無顯著性差異(P>0.05)。 方法7 模型組大鼠的血清尿酸(P<0.01)和尿素氮水平顯著性上升(P<0.05),而肌酐無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、黃嘌呤氧化酶(XO)活性的變化情況

AST 和ALT 是臨床上常用于反應(yīng)肝損傷情況的指標(biāo)。 如表3 所示,單次使用氧嗪酸鉀造模,方法1 和方法2 模型組大鼠的血清 AST 和ALT 活性相較于正常組無顯著性變化(P>0.05)。 連續(xù)7 d 用氧嗪酸鉀單獨造?；蚵?lián)合造模后,與各方法中正常組相比,方法3 模型組大鼠的血清AST 和ALT 活性均無顯著性差異(P>0.05),方法4 模型組大鼠血清AST 活性顯著性上升(P<0.05),ALT 活性無明顯變化(P>0.05);方法5 模型組大鼠 AST 和 ALT 活性均顯著性增高(P<0.05)。 連續(xù)14 d 用氧嗪酸鉀單獨造?；蚵?lián)合造模后,與各方法中正常組相比,方法6 模型組大鼠的血清AST 和ALT 活性無顯著性變化(P>0.05),方法7 模型組大鼠的血清AST 活性顯著升高(P< 0.05), ALT 活性無明顯變化(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清AST、ALT 活性的變化情況()Table 3 Changes of serum AST, ALT activity in each group of rats

表3 各組大鼠血清AST、ALT 活性的變化情況()Table 3 Changes of serum AST, ALT activity in each group of rats

注:各方法的模型組與正常組比較,#P<0.05。Note. Comparison of model group with normal group for each method, #P<0.05.

方法分類Method classification組別Groups AST 活性(U/L)AST activity ALT 活性(U/L)ALT activity方法1 Method 1方法2 Method 2方法3 Method 3方法4 Method 4方法5 Method 5方法6 Method 6方法7 Method 7正常組 Normal group 30.4±13.1 22.9±11.2模型組 Model group 33.1±0.8 20.1±7.8正常組 Normal group 30.5±12.1 23.1±10.2模型組 Model group 29.7±11.5 26.4±3.9正常組 Normal group 33.2±13.8 20.5±5.3模型組 Model group 35.5±3.5 15.8±4.4正常組 Normal group 31.3±7.8 25.5±11.1模型組 Model group 54.9±19.6# 20.5±9.3正常組 Normal group 29.2±6.9 9.0±3.2模型組 Model group 41.2±7.6# 13.8±1.8#正常組 Normal group 33.1±11.6 20.5±5.2模型組 Model group 50.0±7.8 17.5±6.0正常組 Normal group 29.1±6.9 9.1±3.1模型組 Model group 42.0±5.4# 9.7±6.4

XO 是生成尿酸的關(guān)鍵酶,XO 活性增加可造成體內(nèi)尿酸生成過多。 如表4 所示,在連續(xù)7 d 用氧嗪酸鉀單獨造?；蚵?lián)合造模后,與各方法中的正常組相比,方法3 模型組大鼠的血清XO 活力無顯著性差異(P>0.05),方法4 和方法5 模型組大鼠的血清XO 活力均顯著性增高(P<0.01)。 在連續(xù)14 d用氧嗪酸鉀單獨造?；蚵?lián)合造模后,與各方法中正常組相比,方法6 模型組大鼠的血清XO 活力顯著性升高(P<0.05),方法7 模型組大鼠的血清XO 活力無明顯變化(P>0.05)。

表4 各組大鼠的XO 活力變化情況(U/L,)Table 4 Changes of XO activity of rats in each group

表4 各組大鼠的XO 活力變化情況(U/L,)Table 4 Changes of XO activity of rats in each group

注:各方法的模型組與正常組比較,##P<0.01。Note. Comparison of model group with normal group for each method,##P<0.01.

方法分類Method classification正常組Normal group模型組Model group方法 3 Method 3 34.16±23.14 35.00±8.69方法 4 Method 4 15.27±1.21 19.54±2.50##方法 5 Method 5 16.55±1.95 25.02±2.87##方法 6 Method 6 16.18±2.13 39.34±3.9##方法 7 Method 7 15.44±1.61 15.33±2.44

2.3 肝腎組織的病理切片

如圖1A~1G 所示,7 種造模方法中正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)均清晰、完整,肝細(xì)胞大小形態(tài)均正常,界限清晰,肝索以中央靜脈為中心呈放射狀規(guī)則排列,結(jié)構(gòu)正常。 如圖 1H~1J、1N 所示,造模方法1、2、3、6 的模型組大鼠肝病理切片均未見明顯病變,肝小葉完整,中央靜脈清晰可見,肝細(xì)胞界限分明,大小正常,肝索排列規(guī)則。 如圖1K 所示,方法4 模型組大鼠肝板結(jié)構(gòu)被破壞,炎性細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微水變性。 如圖1L 所示,方法5模型組大鼠肝小葉被破壞,肝細(xì)胞水腫,肝細(xì)胞核大小不一。 如圖1M 所示,方法7 模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不完整,肝細(xì)胞出現(xiàn)水變性,脂肪病變,肝索排列不規(guī)則。

圖1 各組大鼠肝組織病理染色示意圖(HE 染色)Note. A, Method 1 normal group. B, Method 2 normal group. C, Method 3 normal group. D, Method 4 normal group. E, Method 5 normal group. F,Method 6 normal group. G, Method 7 normal group. H, Method 1 model group. I, Method 2 model group. J, Method 3 model group. K, Method 4 model group. L, Method 5 model group. N, Method 6 model group. M, Method 7 model group.Figure 1 Schematic diagram of pathological staining of rat liver tissue in each group(HE staining)

如圖2A~2G 所示,7 種造模方法中正常組大鼠腎小球大小、形態(tài)均正常,邊界清晰,鮑曼氏囊腔明顯,腎小管結(jié)構(gòu)正常清晰,上皮細(xì)胞排列整齊。 如圖 2H~2J 示,方法 1、2、3 模型組大鼠腎病理切片未發(fā)現(xiàn)明顯病變,腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)、大小均正常,腎間質(zhì)無炎性浸潤。 如圖2K 所示,方法4 模型組大鼠腎小球萎縮,微量炎性細(xì)胞外漏,腎小管管腔擴張。 如圖2L 所示,方法5 模型組大鼠腎小管和上皮細(xì)胞病變嚴(yán)重,腎小管細(xì)胞空泡變性和上皮細(xì)胞腫脹,部分上皮細(xì)胞脫落,出現(xiàn)腎小管管型,腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞的浸潤且伴有水腫。 如圖2N 所示,方法6 模型組大鼠腎小管和上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,部分腎小管上皮細(xì)胞脫落,胞漿淡然。 如圖2M 所示,方法7 模型組大鼠腎小球出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮現(xiàn)象,大小和形態(tài)均被破壞,上皮細(xì)胞排列不整齊,部分上皮細(xì)胞脫落。

圖2 各組大鼠腎組織病理染色示意圖(HE 染色)Note. A, Method 1 normal group. B, Method 2 normal group. C, Method 3 normal group. D, Method 4 normal group. E, Method 5 normal group. F,Method 6 normal group. G, Method 7 normal group. H, Method 1 model group. I, Method 2 model group. J, Method 3 model group. K, Method 4 model group. L, Method 5 model group. N, Method 6 model group. M, Method 7 model group.Figure 2 Schematic diagram of pathological staining of rat kidney tissue in each group(HE staining)

2.4 腎ABCG2 蛋白的表達(dá)

ABCG2 編碼分泌性尿酸轉(zhuǎn)運蛋白,其主要在腸道和腎近端小管刷狀緣中調(diào)節(jié)尿酸排泄,若ABCG2缺乏,尿酸排泄減少[8]。 本研究采用蛋白質(zhì)印跡分析單用氧嗪酸鉀造模、氧嗪酸鉀聯(lián)合果糖造模、氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤造模這三種造模方法對于腎尿酸轉(zhuǎn)運體ABCG2 蛋白表達(dá)的影響。 實驗結(jié)果如圖3A~3B 所示,與各方法中正常組相比,方法3 模型組大鼠 ABCG2 蛋白表達(dá)無顯著性差異(P>0.05),方法4 和方法5 模型組大鼠腎ABCG2 蛋白表達(dá)顯著性下降(P<0.05)。

圖3 腎ABCG2 蛋白的表達(dá)情況Note. A, Data were analyzed using Western blot. B, Ratio of ABCG2/β-action. 3-N, 4-N, 5-N are the normal groups of methods 3, 4, 5 respectively. 3-M, 4-M, 5-M are the model groups of methods 3, 4,5 respectively. Comparison of model group with normal group for each method, *P<0.05, **P<0.01.Figure 3 Expression of kidney ABCG2 protein

3 討論

尿酸是人類體內(nèi)嘌呤物質(zhì)經(jīng)過一系列酶反應(yīng)的最終產(chǎn)物,其中,XO 是尿酸生成的關(guān)鍵酶,可催化黃嘌呤氧化成尿酸[9]。 人體內(nèi)尿酸大部分由腎排泄出體外,小部分由腸道負(fù)責(zé)排泄出體外。 嘌呤攝入過多或嘌呤代謝酶功能異常所造成的尿酸分泌過多和腎尿酸排泄不足是高尿酸血癥的主要病因[10]。

根據(jù)高尿酸血癥的發(fā)病機制,現(xiàn)有的實驗研究中多采用增加尿酸前體物質(zhì)(如酵母、腺嘌呤)、減少尿酸排泄(如氧嗪酸鉀、乙胺丁醇))、基因改造(敲除GLUT9)等方法進(jìn)行單一或聯(lián)合建造高尿酸血癥模型。 Chen 等[11]采用10%酵母提取物糊劑按照7.5 g/(kg·d)飼養(yǎng)大鼠5 周成功建立的高尿酸血癥大鼠模型,但酵母粉灌胃體積大,易造成實驗動物損害或死亡。 沈桂芹等[12]用300 mg/kg 氧嗪酸鉀與250 mg/kg 乙胺丁醇聯(lián)合造模,大鼠血尿酸出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象。 Diwan 等[13]發(fā)現(xiàn)喂4周含0.75%腺嘌呤飼料大鼠的血清尿素氮和肌酐、蛋白尿水平升高,出現(xiàn)腎纖維化、高脂血癥和血管鈣化等特征,這是因為腺嘌呤會形成極難溶于水的2,8-二羥基腺嘌呤,沉積于腎小管及其腎間質(zhì),引起以腎間質(zhì)小管損傷為主的腎衰竭[14],這種造模方式不符合臨床上高尿酸血癥的發(fā)病機制。 Lu 等[15]在純C57BL/6J 小鼠上通過敲除尿酸酶基因,小鼠尿酸水平超過420 mmol/L,但小鼠腎損傷嚴(yán)重且存活率低。 因此,本研究綜合前人研究,結(jié)合高尿酸臨床發(fā)病機制和大鼠尿酸代謝特點,采用了尿酸前體物質(zhì)和尿酸排泄抑制劑進(jìn)行造模,希望更好地建立高尿酸血癥模型。

本研究選擇氧嗪酸鉀、果糖、次黃嘌呤三種造模劑單用或聯(lián)用建造高尿酸血癥模型,其主要原理如下所述。 人類在進(jìn)化中編碼尿酸酶的基因沉默失活,但嚙齒類動物編碼尿酸氧化酶的基因并未沉默,尿酸氧化酶可將尿酸分解為尿囊素從而排除體外[16],故嚙齒類動物體內(nèi)不易造成高尿酸血癥。 為了減少大鼠與人類體內(nèi)對于尿酸代謝的差距,需抑制大鼠體內(nèi)的尿酸氧化酶活性。 氧嗪酸鉀為三氮雜苯類化合物,其結(jié)構(gòu)與尿酸的嘌呤環(huán)類似,可競爭性地與尿酸酶結(jié)合,抑制尿酸分解為尿囊素排出體外,從而易造成大鼠體內(nèi)尿酸升高[17]。 因此,本研究主要選擇氧嗪酸鉀單用或與其他藥物聯(lián)用構(gòu)建高尿酸血癥模型。 本研究單用氧嗪酸鉀單次造模、連續(xù)7 d 造模和連續(xù)14 d 造模均發(fā)現(xiàn)模型組相對于正常組血尿酸顯著性升高。 單用氧嗪酸鉀連續(xù)造模14 d 相較于連續(xù)造模7 d 模型組尿酸值上升不多,這可能是當(dāng)尿酸濃度升高,對尿酸氧化酶具有反饋性調(diào)節(jié),尿酸氧化酶的表達(dá)或活性增加,導(dǎo)致尿酸濃度有所降低。 本研究同時還采用了果糖進(jìn)行造模,是由于果糖在果糖激酶的催化下磷酸化為果糖1-磷酸,降低胞內(nèi)磷酸鹽和ATP 的水平。細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽快速減少會刺激AMP 降解為次黃嘌呤,次黃嘌呤在XO 的作用下最終產(chǎn)生尿酸[18],使體內(nèi)尿酸升高。 本研究大鼠用果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀連續(xù)造模7 d 和14 d 均能使尿酸顯著性上升,相較于單用氧嗪酸鉀造模,該造模方式尿酸值穩(wěn)定。 與正常組相比,果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀連續(xù)造模7 d 模型組XO 活性無顯著性差異,連續(xù)造模14 d 模型組XO 活性具有顯著性差異,這可能說明果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀造模適合建立長期、穩(wěn)定的高尿酸血癥模型。 本研究采用次黃嘌呤,是因為次黃嘌呤為尿酸的前體物質(zhì),其在一系列酶的作用下最終可轉(zhuǎn)換成尿酸,從而使體內(nèi)尿酸升高[19]。 本研究大鼠用次黃嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀造模尿酸值是單用氧嗪酸鉀造模的3 倍,這說明次黃嘌呤能使尿酸含量非常顯著上升。

腎是尿酸主要的排泄器官,高尿酸血癥往往會導(dǎo)致尿酸及其結(jié)晶沉積在腎中,從而造成不同程度的腎功能損傷。 研究表明,可溶性尿酸具有氧化和促炎作用[20],可誘導(dǎo)腎足細(xì)胞損傷[21]。 尿酸水平的升高會導(dǎo)致腎內(nèi)皮功能紊亂,從而增加慢性腎病的風(fēng)險[22]。 尿酸溶解度下降和過飽和會造成尿酸鈉晶體的形成,尿酸鈉晶體在腎中的直接沉積會引起腎小管間質(zhì)的損傷,從而可引起慢性尿酸性腎病、急性尿酸性腎病和尿酸性腎石癥[23]。 本研究單用氧嗪酸鉀造模發(fā)現(xiàn),模型組大鼠尿素氮水平顯著升高,肌酐無顯著性差異,出現(xiàn)輕微腎損傷,與Chen等[24]研究結(jié)果一致,說明單用氧嗪酸鉀造模只適合建立急性高尿酸血癥伴隨輕微腎損傷模型。 本研究氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤造模,肌酐和尿素氮顯著上升,腎損傷嚴(yán)重,這可能是由于次黃嘌呤自身能增強大鼠腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性所導(dǎo)致的[25],說明氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤適合建立急性高尿酸血癥伴隨嚴(yán)重腎損傷模型。本研究氧嗪酸鉀聯(lián)合果糖連續(xù)造模7 d 時未出現(xiàn)腎損傷,連續(xù)造模14 d 出現(xiàn)輕微腎損傷,說明氧嗪酸鉀聯(lián)合果糖適合建立慢性高尿酸血癥逐漸伴隨腎損傷的模型。

研究表明,高尿酸血癥與脂肪肝的患病率成獨立正相關(guān)關(guān)系[26]。 高尿酸可以直接刺激肝細(xì)胞的脂肪合成,導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷和胰島素敏感性下降相關(guān)[27]。 本研究單用氧嗪酸鉀造模7 d 或14 d 的模型組大鼠血清AST 活性顯著上升,但ALT 活性無顯著變化,肝病理切片中肝細(xì)胞出現(xiàn)了輕微的脂肪變性,說明單用氧嗪酸鉀連續(xù)造模7 d 或14 d 會造成輕微肝損傷。 氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤造模的大鼠血清AST 和ALT 活性均顯著升高,且肝病理切片中肝細(xì)胞出現(xiàn)了輕微的脂肪變性,說明氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤造模會造成較嚴(yán)重肝損傷,這可能是由于體內(nèi)尿酸的升高從而引起肝脂肪合成增加所導(dǎo)致的。 有研究報道,果糖可誘導(dǎo)肝脂肪堆積[28],但本研究果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀造模的大鼠血清AST 和ALT 活性均無變化,且肝病理切片并未發(fā)現(xiàn)明顯肝病變,可能是由于造模時間短尚未引起上述病變,這與李琴等[29]用5%果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀造模兩周,但未發(fā)現(xiàn)肝有損傷的結(jié)果一致,這說明果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀造模短期內(nèi)不會造成肝損傷。

綜上所述,本實驗成功構(gòu)建了幾種不同程度肝腎損傷的高尿酸血癥大鼠模型。 分析模型結(jié)果可知,單用氧嗪酸鉀連續(xù)造模7 d 適合短期內(nèi)建立急性高尿酸血癥伴隨輕微肝腎損傷模型。 用5%果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀造模更貼近人類因為高糖飲食可誘導(dǎo)的高尿酸血癥,該造模方式適合建立肝腎損傷小的慢性高尿酸血癥動物模型。 次黃嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀適合建立肝腎損傷嚴(yán)重的高尿酸血癥模型。但這些模型的具體機制和應(yīng)用還需進(jìn)一步探索,以便為高尿酸血癥模型建立提供更全面科學(xué)的依據(jù)。