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        干擾hTERT增強光動力療法誘導宮頸癌細胞凋亡的體外實驗

        2021-11-17 02:56:46黃守國宗麗菊張友忠
        現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展 2021年11期
        關(guān)鍵詞:端粒酶孵育宮頸癌

        王 頡,黃守國,宗麗菊,張友忠

        (1.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬??卺t(yī)院婦產(chǎn)科,???570208;2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100730;3.山東大學齊魯醫(yī)院,濟南 250012)

        宮頸癌是我國目前發(fā)病率和死亡率較高的婦科惡性腫瘤之一,嚴重威脅女性的健康及生命,隨著宮頸癌篩查的推廣及越來越多抗腫瘤藥物的出現(xiàn),宮頸癌的治療已取得了很大的進步,但仍有很多患者存在轉(zhuǎn)移及復發(fā),預(yù)后差,因此仍需不斷探索新的輔助治療手段[1-2]。光動力療法(photodynamic therapy,PDT)利用光敏劑和激發(fā)光源靶向治療腫瘤,成為繼手術(shù)、放化療之后的新的微創(chuàng)療法,已用于治療皮膚癌、肺癌、宮頸癌、早期食管癌等[3]。四甲基吡啶卟啉[meso-5,10,15,20-Tetrakis-(N-methyl-4-pyridyl)porphine,TMPyP4]作為四價陽離子卟啉化合物,是一種人工合成的新型水溶性光敏劑,其進入細胞后通過結(jié)合并穩(wěn)定端粒序列上的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu),抑制端粒酶活性。早有研究證明,TMPyP4-PDT可加速宮頸癌細胞的調(diào)亡,從而有效抑制宮頸癌細胞的生長[4-5]。hTERT作為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的催化亞基,只在腫瘤組織中表達,對hTERT基因進行有效干擾會有效抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[6]。本研究擬通過干擾下調(diào)hTERT表達,觀察能否增強光動力療法對宮頸癌的作用,并探索其可能的作用機制,從而為探討宮頸癌新的治療手段提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑 人宮頸癌Caski細胞株(本實驗室保存),Lenti-hTERT-shRNAs、Polybrene(上海吉瑪),RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒(TaKaRa),RT-PCR引物(上海博尚),流式凋亡試劑盒(美國BD),hTERT、SP-1兔抗人單克隆抗體(Abcam),Bcl-2、Bax、caspase-3單克隆抗體(Santa Cruz),熒光二抗羊抗兔IgG(Abbkine)。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在37℃、5% CO2、飽和濕度孵育箱中用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Caski細胞,選取對數(shù)生長期細胞。轉(zhuǎn)染前24h,將細胞按20×104細胞/孔接種于6孔板,待細胞融合至60%左右,將慢病毒按說明進行轉(zhuǎn)染(MOI為20,Polybrene使用濃度為5μg/mL),將四個干擾片段sh-1、sh-2、sh-3、sh-4分別轉(zhuǎn)染至各孔,轉(zhuǎn)染后72h觀察轉(zhuǎn)染效率并篩選出有效干擾片段。

        1.2.2 hTERT干擾片段的轉(zhuǎn)染與篩選 轉(zhuǎn)染后72h,提取各孔細胞總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,GAPDH作為內(nèi)參比較各組細胞中hTERT基因的表達。選取表達量最低的sh-RNA組,利用免疫熒光的方法對初篩結(jié)果進行驗證,經(jīng)爬片(4%多聚甲醛固定,30min),室溫通透(1% TritomX-100,30min),室溫封閉(山羊血清,30min),hTERT抗體孵育過夜(1∶100,4℃),熒光二抗羊抗兔IgG(1∶200),室溫避光孵育1h,DAPI避光染核5min,抗熒光淬滅的封片劑封片,觀察hTERT蛋白表達情況,結(jié)果用Image Pro-Plus 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。

        1.2.3 實驗分組 空白對照組(A組);TMPyP4-PDT組(B組):將TMPyP4用DMEM培養(yǎng)基(不含血清)配置成750μmol/L的儲存液(嚴格避光、無菌),選取宮頸癌Caski細胞,給予7.5μmol/L的TMPyP4工作液,37℃、飽和濕度、5% CO2條件下避光孵育4h后進行光照。光照條件:波長470nm,功率為0.4W,激光能量密度為4J/cm2,光照時間為1min。光照后所有細胞換成完全培養(yǎng)液。干擾hTERT組(C組):成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lenti-hTERT-sh4的Caski細胞;聯(lián)合處理組(D組):選取成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lenti-hTERT-sh4的Caski細胞,給予和B組同樣的處理。照光24h后,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,48h后提取RNA進行RT-PCR,72h后提取蛋白進行Western blot實驗。

        1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 照光24h后,將細胞接種于6孔板,調(diào)整細胞濃度為105~106細胞/mL,按凋亡檢測試劑盒說明進行操作,于1h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率情況,實驗重復3次。

        1.2.5 RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、SP-1 mRNA表達 照光48h后,采用Trizol法提取細胞總RNA,檢測其濃度及純度后,進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):20μL,37℃ 15min、85℃ 5s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行RT-PCR反應(yīng):10μL體系,95℃ 10s,1個循環(huán);95℃ 5s、57℃ 30s、72℃ 30s,40個循環(huán);65℃ 15s。GAPDH作為內(nèi)參,PCR反應(yīng)引物序列:hTERT:F:5'-TCACGGAGACCACGTTTCAAA-3',R:5'-TTCAAGTGCTGTCTGATTCCAAT-3';Bcl-2:F:5'-TGGCCAGGGTCAGAGTTAAA-3',R:5'-TGGCCTCTCTTGCGGAGTA-3';Bax:F:5'-TTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3',R:5'-AGACACTCGCTCAGCTTCTTG-3';caspase-3:F:5'-TAAATGAATGGGCTGAGCTG-3',R:5'-ATGGAGAAATGGGCTGTAGG-3';SP-1:F:5'-AACCCACAAGCCCAAACAATCACC-3',R:5'-CCCCGAGCCCCTTCCTTCACT-3';GAPDH:F:5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3',R:5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。用2-△△CT方法分析以上基因mRNA相對表達量。實驗重復3次。

        1.2.6 Western blot檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、SP-1蛋白表達 照光72h,提取各組處理后的細胞總蛋白,測定蛋白濃度,取30μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉;分別加兔抗人Bcl-2、Bax、caspase-3、SP-1單克隆抗體(1∶1000)及小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶500),孵育、洗膜,ECL法進行分析。實驗重復3次。

        2 結(jié) 果

        2.1 獲得hTERT干擾的細胞 所有干擾片段中,轉(zhuǎn)染sh-4細胞的hTERT表達量明顯降低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結(jié)果見圖1。sh-4作為有效干擾片段用于后續(xù)實驗。

        圖1 hTERT有效干擾片段的篩選

        2.2 干擾hTERT增強光動力療法對宮頸癌細胞的誘導凋亡 空白對照組、TMPyP4-PDT組、轉(zhuǎn)染hTERT組、聯(lián)合處理組細胞的早期凋亡率分別為(3.68±0.5352)%、(28.79±0.8473)%、(12.13±0.6225)%、(57.88±1.07)%。給予hTERT轉(zhuǎn)染和TMPyP4-PDT的聯(lián)合處理組的細胞早期凋亡率明顯高于其他3組(P<0.05),而TMPyP4-PDT組和轉(zhuǎn)染sh-4組的早期凋亡率較空白對照組明顯增加(P<0.05),且兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

        2.3 干擾hTERT聯(lián)合光動力療法降低Bcl-2、SP-1 mRNA表達和上調(diào)Bax、caspase-3 mRNA表達 見圖2。轉(zhuǎn)染hTERT的細胞,接受TMPyP4-PDT后caspase-3、Bax mRNA表達量明顯增加(P<0.01),SP-1、Bcl-2 mRNA表達量明顯下降(P<0.01),Bcl-2/Bax比值相應(yīng)增加(P<0.01),而其余兩組之間無明顯差異(P>0.05)。

        圖2 四組宮頸癌細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、SP-1 mRNA表達

        2.4 干擾hTERT聯(lián)合光動力療法降低Bcl-2、SP-1蛋白表達和上調(diào)Bax、caspase-3蛋白表達 與單獨處理組和空白對照組相比,給予hTERT轉(zhuǎn)染和TMPyP4-PDT聯(lián)合處理的細胞組Bcl-2、SP-1蛋白表達量明顯減少(P<0.05),Bax、caspase-3蛋白表達量明顯增多(P<0.05)。TMPyP4-PDT組和轉(zhuǎn)染sh-4組的Bcl-2、Bax蛋白表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);兩組的SP-1、caspase-3蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

        圖3 宮頸癌細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、SP-1蛋白的表達

        3 討 論

        宮頸癌的發(fā)生是一個多基因參與的多步驟過程,目前發(fā)病率日漸升高,手術(shù)、放療、化療作為宮頸癌的基本治療方法,其存在的風險及某些不良反應(yīng)讓許多患者無法耐受[7]。光動力治療利用光敏劑和一定波長的光源對照射部位的病變組織、細胞產(chǎn)生殺傷作用,是一種對正常組織無損傷、靶向性好的治療方法,特別對于年輕有生育要求的早期宮頸癌患者及年老不適宜手術(shù)的宮頸癌患者,是一種可選擇的治療手段[8]。TMPyP4是較早發(fā)現(xiàn)的G-四聯(lián)體穩(wěn)定劑,可選擇性聚集于腫瘤細胞細胞核[9],TMPyP4的作用效果已在宮頸癌、卵巢癌、肝癌等細胞中得到證實[10-11],近年來TMPyP4在腫瘤的光動力治療中備受關(guān)注。端粒酶在正常組織中不表達或低表達,而在許多腫瘤組織中呈高表達狀態(tài),因此其可能參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制[12]。hTERT作為端粒酶的活性成分,利用慢病毒作為載體將其有效干擾,轉(zhuǎn)染至宮頸癌細胞,定位于細胞核使端粒長度不能得到維持,從而加速細胞凋亡。以上兩種治療方法均能準確定位于細胞核而起到殺傷腫瘤細胞的作用。

        Bcl-2家族是最早被發(fā)現(xiàn)的與細胞凋亡相關(guān)的蛋白,在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮重要作用[13]。抑制細胞凋亡的Bcl-2和促進細胞凋亡的Bax相互拮抗,兩者之間的比例是決定細胞凋亡還是存活的關(guān)鍵,Bax蛋白高表達時促進細胞凋亡,Bcl-2蛋白高表達時抑制細胞凋亡[14]。caspase是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵元素,其激活與過表達均可引起細胞凋亡[15],caspase-3位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游,是最重要的效應(yīng)型caspase,是細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者,是多種凋亡信號傳遞的匯聚點,其活化是凋亡進入不可逆階段的標志[16]。SP-1作為轉(zhuǎn)錄因子的成員之一,在胃癌、胰腺癌、乳腺癌及甲狀腺腫瘤細胞中高表達[17-18],是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的一個重要因素,這與其能激活與腫瘤生長相關(guān)的基因有關(guān),如hTERT、SP-1轉(zhuǎn)錄因子明顯促進端粒酶活性和hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄活性[19]。本研究顯示,聯(lián)合處理組(成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lenti-hTERT-sh4的Caski細胞并給予7.5μmol/L的TMPyP4治療),其凋亡相關(guān)基因Bax、caspase-3表達均增加,Bcl-2表達減少,轉(zhuǎn)錄因子SP-1的表達也減少,表明干擾hTERT的表達可增強光動力治療的療效,可能作用機制是通過加速細胞凋亡和(或)特異地降低端粒酶的活性而實現(xiàn)。

        綜上所述,通過體外實驗發(fā)現(xiàn)干擾hTERT可增加Bax、caspase-3表達,降低Bcl-2、SP-1表達,增強光動力療法對宮頸癌細胞的誘導凋亡作用,從而為宮頸癌的光動力治療提供了一定的理論依據(jù)。

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