陳英蘋,周 琴,史 燁,張 玢,王 晶,劉建兵

(南京醫(yī)科大學附屬常州市婦幼保健院，常州 213003)

胎兒超聲是產前篩查與診斷的重要方法，對診斷胎兒染色體異常有重要的指導意義。胎兒超聲異常主要包括結構異常和軟指標異常兩大類型。對于超聲結構異常，歐美及我國先后發(fā)表指南，推薦染色體微陣列技術(chromosomal mlcroarray analysis,CMA)作為首選的診斷方法[1-4]。而對于超聲軟指標異常是否需行介入性產前診斷，可否采用孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查(non-invasive prenatal testing,NIPT)，存有較大爭議[5]。本研究回顧分析了本中心胎兒超聲異常產前篩查與診斷及隨訪結果，探討CMA及NIPT技術在胎兒超聲異常產前篩查與診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2016年1月至2020年6月因胎兒超聲異常在常州市婦幼保健院產前診斷中心就診，知情同意自愿接受羊水產前診斷，進行核型分析和(或)CMA檢測的孕婦，共356例，均為單胎妊娠，孕齡17～30周，年齡20～47歲。選取同期因單一超聲軟指標異常(單枚左心室強光點、脈絡膜囊腫、單臍動脈)，知情同意拒絕羊水產前診斷、自愿選擇NIPT的單胎非高齡孕婦415例，孕齡15～26周，年齡20～34歲。

1.2 研究方法

1.2.1 胎兒超聲檢查 胎兒超聲異常包括超聲結構異常及軟指標異常。使用超聲設備為G60S彩色多普勒超聲診斷儀(德國西門子公司)，診斷標準參考《胎兒畸形產前超聲診斷學》[6]及相關文獻指南[7]。涉及胎兒超聲結構異常包括：神經系統(tǒng)畸形、顏面頸部畸形、呼吸系統(tǒng)畸形、心血管系統(tǒng)畸形、消化系統(tǒng)畸形、泌尿系統(tǒng)畸形、骨骼系統(tǒng)畸形、多發(fā)畸形、羊水量異常、胎兒生長受限、其他畸形(胎兒水腫及腫瘤)。涉及胎兒超聲軟指標異常包括：NT/NF增厚、側腦室輕度增寬、脈絡膜囊腫、鼻骨發(fā)育不良、心室強光點、腸管回聲增強、單臍動脈、三尖瓣反流。

1.2.2 NIPT檢測 孕婦知情同意后，采集外周血10mL置于EDTA抗凝管，4h以內分離血漿，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(德國Qiagen公司)試劑盒提取血漿游離DNA，構建文庫。采用Illumina NextSeq500測序平臺進行測序，獲得不低于400M的有效reads數，平均每個樣本不低于4M的reads。運行序列比對軟件BWA map將測序所得序列比對至人類基因組參考序列圖譜。使用自有軟件BGPDv2.0.1針對比對結果進行每條染色體序列個數統(tǒng)計。計算每條染色體reads所占比例(%hrN)，并計算各個染色體Z值。利用Z值評估樣本的實際患病情況(cutoff：|Z|=3)[8]。

1.2.3 CMA檢測 對超聲異常及NIPT結果異常孕婦均進行產前遺傳咨詢，經知情同意后在超聲引導下行羊膜腔穿刺術，羊水標本提取DNA，依次進行酶切消化、連接、PCR擴增、產物純化、定量、片段化處理、標記、雜交等過程，洗滌脫色，AffymetrixCytoScan750k芯片掃描獲得數據，并對所得的原始數據進行分析。參照國際基因組CNV多態(tài)性數據庫DGV、OMIM、DECIPHER、ISCA等數據庫以及相關文獻判讀CNVs。結果解讀報告嚴格按美國醫(yī)學遺傳學會指南。

1.2.4 隨訪 采用病案查詢和電話等方式對妊娠結局、新生兒健康狀況進行隨訪。

2 結 果

2.1 胎兒超聲異常產前診斷結果 356例因胎兒超聲異常接受產前診斷的孕婦共檢出44例致病性異常，異常率12.36%(44/356)，其中非整倍體異常30例(8.43%)，致病性微缺失或微重復14例(3.93%)。根據超聲異常分類，多發(fā)畸形異常率最高，達41.67%，其他依次為羊水量異常(1/4)、骨骼系統(tǒng)畸形(2/10)、神經系統(tǒng)畸形(1/7)。其中多發(fā)畸形、軟指標陽性、羊水量異常以非整倍體異常為主，而神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)則以致病性拷貝數變異(PCNV)為主(表1)。

表1 不同類型胎兒超聲異常產前診斷結果一覽表

180例超聲軟指標陽性孕婦共檢出22例致病性異常，檢出率為12.22%(22/180)，包括17例(9.39%)非整倍體異常，5例(2.94%)致病性微缺失或微重復。NT/NF增厚異常率最高，達19.6%(12/61)，其他依次為腸管回聲增強(1/7)、鼻骨發(fā)育不良(5/42)、多種軟指標異常(3/28)、側腦室輕度增寬(1/22)，單純性脈絡膜囊腫、心室強光點、單臍動脈、三尖瓣返流未發(fā)現異常。見表2。

表2 不同類型超聲軟指標產前診斷結果

2.2 單一超聲軟指標異常的NIPT結果 在文獻及上述研究結果的基礎上，我們對3種單一胎兒超聲軟指標陽性孕婦在充分知情同意后謹慎選擇NIPT技術，共415例孕婦，包括198例脈絡膜囊腫、184例心室強光點和33例單臍動脈。經NIPT檢測，胎兒單純脈絡膜囊腫孕婦中，2例NIPT提示18-三體高風險，后經羊水產前診斷確診(表3)。其余已隨訪的387例病例中，除1例單臍動脈孕婦妊娠20周發(fā)生難免流產外，暫未發(fā)現結局不良病例，出生新生兒隨訪中暫未出現T21/T18/T13漏診病例。

表3 不同單一超聲軟指標異常的NIPT結果

3 討 論

無創(chuàng)傷、可重復的超聲篩查是產前篩查與診斷的重要手段，在出生缺陷防治方面發(fā)揮巨大作用[9]，它通過檢查出染色體異?？赡芩碌幕位蛳嚓P細微結構變化，再行介入性產前診斷，從而診斷出胎兒有無染色體異常。傳統(tǒng)的染色體核型分析需要進行細胞培養(yǎng)，耗時長，分辨率低，只能檢測出5～10Mb的染色體片段的重復和缺失，而CMA則能檢測出染色體微缺失、微重復等細微結構異常，目前已廣泛應用于超聲檢查異常的胎兒中[10]。本研究中，356例超聲異常共檢出44例致病性異常，包括非整倍體30例(8.43%)，致病性微缺失或微重復14例(3.93%)，CMA檢測增加了31.82%(14/44)染色體異常的發(fā)現。由此可見，CMA檢測是超聲異常的產前診斷的關鍵方法，可有效提高致病性異常檢出率，起著重要作用。

胎兒軟指標是指超聲發(fā)現胎兒微小的、一過性存在的非結構性改變，對胎兒染色體異常有提示作用[11]。但迄今為止，關于單純性胎兒軟指標產前診斷的研究報道甚少。本研究180例超聲軟指標陽性樣本中，共檢出22例致病性異常，檢出率為12.22%(22/180)。異常率最高為NT/NF增厚(19.6%)，其他依次為腸管回聲增強(14.28%)、鼻骨發(fā)育不良(11.90%)、多種軟指標異常(10.71%)、側腦室輕度增寬(4.55%)。故對于異常率較高的軟指標異常(如NT/NF增厚、腸管回聲增強、鼻骨發(fā)育不良)或合并多個軟指標異常，建議直接行介入性產前診斷。然而本研究臨床數據尚有限，有待進行更深入、更大樣本量的研究。

NIPT作為一項新型的產前非侵入性高精度篩查方法，對于檢測胎兒21-三體和18-三體檢測具有較高的敏感性和準確性，其結果與染色體核型分析具有較高的一致性[12]。本研究根據以往臨床研究結果，在充分知情同意下對單一超聲軟指標異常(脈絡膜囊腫、心室強光點、單臍動脈)拒絕行羊水產前診斷而要求行NIPT，結果顯示，198例脈絡膜囊腫樣本中發(fā)現2例18-三體綜合征，異常率1.01%，184例心室強光點及33例單臍動脈樣本中未發(fā)現結果異常。而表2行產前診斷的脈絡膜囊腫、心室強光點、單臍動脈樣本中，結果亦未發(fā)現異常。正常胎兒脈絡膜囊腫發(fā)生率為1%～2%，并于孕26周消失，故早期發(fā)現單純的脈絡膜囊腫，可動態(tài)觀察，若存在其他高危因素可再考慮行產前診斷。胎兒軟指標陽性染色體異常多見于非整倍異常，NIPT對于檢測常見的21-三體、18-三體均具有較高的準確性，且隨著目前測序深度的不斷增加、信息分析方法的逐漸優(yōu)化，NIPT對染色體部分微缺失微重復亦有一定的檢出率。故對于單一的脈絡膜囊腫、心室強光點、單臍動脈可先行NIPT，從而減少侵入性產前診斷所帶來的流產、感染等風險。

綜上所述，CMA技術可顯著提高胎兒超聲異常產前診斷的異常染色體檢出率，可作為首選方法。胎兒超聲軟指標異常因類型不同，染色體異常檢出率存在明顯差異，故在實際臨床工作中產前診斷醫(yī)師應綜合評估分析，選擇適宜的產前診斷技術。對于致病性CNV較低的單一軟指標陽性，亦可考慮先行NIPT，同時加強后期圍產期的監(jiān)護。