高亞誼，張琍鈞，王興玲，劉 慧，王靜靜，田萌萌

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心，鄭州 450052；2.河南省人民醫(yī)院，鄭州 450003；3.焦作市婦幼保健院生殖中心，焦作 454100)

輔助生殖技術(shù)治療的目標(biāo)是單胎、足月、健康嬰兒的誕生[1]。研究發(fā)現(xiàn),選擇性單囊胚移植能在不損害臨床妊娠率的情況下顯著降低多胎妊娠率[2-3]，從而降低與多胎妊娠相關(guān)的圍產(chǎn)期并發(fā)癥[4-5]、產(chǎn)后抑郁和焦慮[6]，以及減少社會(huì)和家庭醫(yī)療經(jīng)濟(jì)壓力[7]等。鑒于專家共識(shí)建議減少囊胚移植數(shù)目[8]，選擇出發(fā)育潛能更高的胚胎就顯得尤為重要。

目前臨床上普遍通過Gardner評(píng)分[9]方法對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，但關(guān)于囊胚形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局獨(dú)立影響的研究較少。因此，評(píng)估囊胚每個(gè)形態(tài)學(xué)特征對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局的獨(dú)立影響，可為臨床單囊胚移植的安全性和有效性提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 檢索2015年8月01日至2019年12月25日在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心接受新鮮或冷凍第5/6天單囊胚移植的婦女的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受體外受精(in vitro fertilization,IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕治療的患者；(2)單囊胚移植周期；(3)首次進(jìn)行新鮮或冷凍胚胎移植的周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)受卵周期;(2)接受胚胎植入前基因檢測(cè)(preimplantation genetic testing，PGT)；(3)妊娠結(jié)局為死胎或同卵雙胎；(4)子宮因素不孕；(5)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；(6)重要數(shù)據(jù)缺失。研究遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 促排卵方案 新鮮周期促排卵方案使用本中心常規(guī)的早卵泡期長(zhǎng)方案和黃體中期長(zhǎng)方案。當(dāng)雙側(cè)卵巢有1～3個(gè)卵泡直徑≥20mm或≥50%～60%的主導(dǎo)卵泡群徑線≥18mm時(shí)，肌肉注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，意大利Merck Serono公司)250μg扳機(jī)。扳機(jī)后36～38h于陰道超聲引導(dǎo)下行陰道后穹窿穿刺取卵術(shù)。

1.3 囊胚培養(yǎng)及評(píng)分 取卵后3～6h，根據(jù)精液樣本和夫婦的病史采用IVF或ICSI對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行分組受精，在16～18h觀察卵母細(xì)胞受精情況，培養(yǎng)至第3天，根據(jù)胚胎的細(xì)胞數(shù)量及碎片進(jìn)行評(píng)分[10]，選擇1～2枚Ⅲ級(jí)以上的卵裂胚進(jìn)行新鮮周期移植或冷凍保存。將剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第5天或第6天，根據(jù)Garnder評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)形成的囊胚進(jìn)行評(píng)估。為了減小主觀誤差，由兩位實(shí)驗(yàn)室胚胎學(xué)家共同進(jìn)行評(píng)估，之后或進(jìn)行新鮮囊胚移植，或?qū)⒛遗呃鋬霰４?。胚胎培養(yǎng)過程均在37℃、6%CO2、5%O2和89%N2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

Garnder評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：囊胚分期：1期:囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期:囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期:完全擴(kuò)張囊胚,囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期:擴(kuò)張囊胚,囊胚腔完全充滿胚胎,透明帶變薄;5期:囊胚的一部分從透明帶中逸出;6期:囊胚全部從透明帶中逸出。囊胚ICM分級(jí)：A級(jí)，細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級(jí)，細(xì)胞數(shù)目很少。TE分級(jí)：A級(jí)，上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級(jí)，上皮細(xì)胞層細(xì)胞不多，結(jié)構(gòu)松散；C級(jí)，上皮細(xì)胞層稀疏。我中心將3期及3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分≥B的囊胚評(píng)為可利用囊胚，用于臨床移植。

1.4 胚胎冷凍及復(fù)蘇 玻璃化冷凍、復(fù)蘇試劑和冷凍載體均購自日本Kitazato公司。胚胎冷凍和復(fù)蘇按說明書標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。胚胎解凍后移入G-2液(Vitrolife瑞典)中培養(yǎng)等待移植。

1.5 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案 冷凍周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案采用本中心常規(guī)方案，分為自然周期、人工周期和刺激周期[11]。對(duì)月經(jīng)周期規(guī)律、有自發(fā)排卵且內(nèi)膜生長(zhǎng)良好的患者采用自然周期；對(duì)于排卵不規(guī)律、無排卵、黃體功能不全或子宮內(nèi)膜較薄的患者，排除雌激素使用禁忌證后采用人工周期；對(duì)于月經(jīng)周期不規(guī)律、有規(guī)律月經(jīng)但自然周期無優(yōu)勢(shì)卵泡或卵泡發(fā)育停滯的患者，采用刺激周期。于內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第5天解凍囊胚進(jìn)行移植。

1.6 胚胎移植后黃體支持 從內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日開始持續(xù)黃體支持至胚胎移植后14天，抽血檢測(cè)血β-HCG，若血β-HCG陽性，則繼續(xù)進(jìn)行黃體支持至胚胎移植后6周。移植后6～7周行陰道超聲檢查，以宮腔內(nèi)見孕囊及胎心搏動(dòng)確定為臨床妊娠，隨后根據(jù)患者情況繼續(xù)黃體支持或逐漸減量至停藥。

1.7 觀察指標(biāo) 主要的觀察指標(biāo)包括大于胎齡兒(large for gestational age,LGA)、小于胎齡兒(small for gestational age,SGA)、早產(chǎn)(preterm birth,PTB)、巨大兒(fetal macrosomia,FM)、低出生體重(low birth weight,LBW)以及子代性別比(secondary sex ratio,SSR)。小于胎齡兒和大于胎齡兒分別為出生體重≤第10百分位數(shù)和≥第90百分位數(shù)[12]，早產(chǎn)定義為妊娠≥28周且<37周分娩，巨大兒定義為出生體重≥4000g，低出生體重指出生體重<2500g，子代性別比以男性新生兒所占百分比表示[13]。

2 結(jié) 果

2.1 患者的基線數(shù)據(jù) 研究共納入1627個(gè)新鮮周期和3052個(gè)冷凍周期，其中812個(gè)新鮮周期和1332個(gè)冷凍周期獲得了單胎活產(chǎn)，單胎活產(chǎn)率分別是49.9%和43.6%。將研究對(duì)象分為活產(chǎn)組與未活產(chǎn)組，活產(chǎn)組較未活產(chǎn)組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH值、Gn總量(僅在新鮮周期中)、起始Gn量(僅在新鮮周期中)較低，而AMH值、HCG日子宮內(nèi)膜厚度(僅在新鮮周期中)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植優(yōu)質(zhì)囊胚比例較高?；町a(chǎn)組的移植優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)明顯高于未活產(chǎn)組。新鮮周期移植優(yōu)質(zhì)囊胚、囊胚形態(tài)學(xué)指標(biāo)評(píng)分較高的比例高于冷凍周期。見表1。

表1 新鮮周期和冷凍周期的活產(chǎn)組與未活產(chǎn)組患者的基線數(shù)據(jù)比較

2.2 囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)活產(chǎn)的影響 影響活產(chǎn)的因素非常復(fù)雜，在檢索數(shù)據(jù)時(shí)排除了部分非胚胎質(zhì)量因素的干擾，同時(shí)以活產(chǎn)結(jié)局為因變量進(jìn)行二元logistic回歸分析時(shí)，調(diào)整了年齡、子宮內(nèi)膜厚度、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、囊胚培養(yǎng)天數(shù)等混雜因素后結(jié)果顯示：囊胚擴(kuò)張分期與活產(chǎn)無明顯相關(guān)(新鮮周期:P=0.117;冷凍周期:P=0.907)；ICM分級(jí)是活產(chǎn)的獨(dú)立影響因素[新鮮周期：OR(95%CI)為0.64(0.51～0.82)，P<0.001；冷凍周期:OR(95%CI)為0.74(0.61～0.93)，P=0.008]。TE分級(jí)是冷凍周期活產(chǎn)的獨(dú)立影響因素(P<0.001)。見圖1。

圖1 新鮮周期和冷凍周期囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)活產(chǎn)的影響A:新鮮周期;B:冷凍周期

2.3 囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局的影響 在活產(chǎn)組中，以圍產(chǎn)兒結(jié)局為因變量分別進(jìn)行二元logistic回歸分析，以其中一個(gè)形態(tài)學(xué)特征為因變量時(shí)，將其他兩個(gè)形態(tài)學(xué)特征也作為混雜因素進(jìn)行矯正，調(diào)整囊胚發(fā)育天數(shù)、年齡、BMI、AMH、移植日子宮內(nèi)膜厚度等混雜因素后結(jié)果顯示：囊胚擴(kuò)張分期與圍產(chǎn)兒結(jié)局(LGA、SGA、FW、LBW、PTB)無明顯相關(guān)(P均>0.05)。然而，由于新鮮周期6期囊胚活產(chǎn)數(shù)量極少，部分變量結(jié)局發(fā)生率為0，關(guān)于新鮮周期囊胚擴(kuò)張分期與圍產(chǎn)兒結(jié)局相關(guān)性的研究結(jié)果意義有限，將來需更大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。見表2。

方法同上，調(diào)整混雜因素后結(jié)果顯示：囊胚ICM分級(jí)和TE分級(jí)與LGA、SGA、FW、LBW、PTB無顯著相關(guān)(P均>0.05)，見表2。ICM評(píng)分與子代性別比趨勢(shì)相反，新鮮周期ICM分級(jí)為“B”的性別比是“A”的2.17倍(95%CI為1.51～2.94,P<0.001)。冷凍周期ICM分級(jí)為“B”的性別比是“A”的1.33倍，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059)。不管是在新鮮周期還是在冷凍周期中，TE分級(jí)都是子代性別比的獨(dú)立影響因素，TE評(píng)分越高，子代性別比就越大，調(diào)整混雜因素后，TE分級(jí)為“B”、“C”較“A”的囊胚子代性別比均降低(P均<0.05)。見表3、4。

表2 囊胚擴(kuò)張分期對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局的影響

表3 囊胚TE分級(jí)對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局的影響[n(%)]

表4 囊胚ICM分級(jí)對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局的影響[n(%)]

3 討 論

由于ICM最終會(huì)發(fā)育成胚胎，傳統(tǒng)上認(rèn)為ICM是預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的重要因素[14]。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，TE是妊娠結(jié)局的重要預(yù)測(cè)因子[15-17]，考慮到TE最終會(huì)發(fā)育成胚外組織從而支持胎兒發(fā)育，其重要性可以預(yù)見。本結(jié)果顯示，囊胚ICM分級(jí)和TE分級(jí)是影響單囊胚移植活產(chǎn)的重要因素，但在新鮮周期和冷凍周期中的結(jié)果并不完全一致。ICM分級(jí)是活產(chǎn)的獨(dú)立影響因素。TE分級(jí)只有在冷凍周期中與活產(chǎn)表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。

囊胚TE分級(jí)和ICM分級(jí)與妊娠結(jié)局之間的相關(guān)機(jī)制，目前尚不明確，但在促進(jìn)胚胎植入中的關(guān)鍵作用無可置疑。高級(jí)別TE細(xì)胞可能更容易分泌人絨毛膜促性腺激素，從而更有效且快速地啟動(dòng)母胎溝通[18]，而ICM可能通過分泌Fgf4來促進(jìn)TE細(xì)胞的增殖[19]。這些數(shù)據(jù)表明，TE和ICM之間的各種相互作用對(duì)于促進(jìn)正常的胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此，這兩類評(píng)分都應(yīng)該盡量選擇高級(jí)別的，以確保最佳的發(fā)育潛能。

Bakkensen等[17]發(fā)現(xiàn)，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與不良的圍產(chǎn)期結(jié)局無明顯相關(guān)性。張建瑞等[20]對(duì)新鮮周期和冷凍周期的妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床妊娠率明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚，但是不同質(zhì)量囊胚的新生兒早產(chǎn)率、低出生體重率等無明顯差異。Bouillon等[21]將799個(gè)單胎活產(chǎn)的周期根據(jù)移植的單囊胚質(zhì)量分為4組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一旦臨床妊娠，無論囊胚的形態(tài)學(xué)如何，其早產(chǎn)率、流產(chǎn)率無顯著差異。本研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，即囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與不良圍產(chǎn)兒結(jié)局無明顯相關(guān)。

以往的研究顯示，胚胎發(fā)育階段與性別相關(guān)的差異非常顯著，男性胚胎產(chǎn)生5級(jí)或6級(jí)囊胚的可能性比女性胚胎高2.6倍[22]。Wang等[23]通過對(duì)233例PGS患者的1559枚胚胎進(jìn)行TE活檢發(fā)現(xiàn)，雄性胚胎更有可能具有更高的TE等級(jí)(P<0.02)。Ebner等[24]也報(bào)道了男性囊胚顯示出TE為“A”的幾率高出女性2.53倍。然而Lou等[25]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TE分級(jí)為“B”的囊胚子代男性比例可能是最高的。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮周期和冷凍周期中TE分級(jí)與子代性別比具有獨(dú)立相關(guān)性，TE分級(jí)越高，子代男性比例就越高。事實(shí)上，已有研究發(fā)現(xiàn)，人類女性胚胎比男性胚胎具有更高的葡萄糖消耗[24]，這可能反映了女性胚胎為了使第二個(gè)X染色體失活而需要更多的能量，從而降低了有絲分裂速度[26]。

與TE分級(jí)相反，本結(jié)果顯示ICM分級(jí)與新鮮周期單胎子代性別比呈負(fù)相關(guān)，ICM分級(jí)為“B”的囊胚子代男性比例明顯高于“A”級(jí)?？赡艿脑蚴悄遗逫CM與TE發(fā)育不同步，TE細(xì)胞數(shù)量在第5天和第6天相似(分別為37.9±6.0和40.3±5.0)，而ICM細(xì)胞數(shù)量在第5天和第6天之間增加了1倍(分別為20.4±4.0和41.9±5.0)[27]。也就是說，由于雄性囊胚發(fā)育較快，第5天囊胚的雄性胚胎比例較高，但I(xiàn)CM細(xì)胞數(shù)量少，評(píng)級(jí)較低；第6天囊胚雄性胚胎比例較第5天降低，但I(xiàn)CM細(xì)胞數(shù)量增多，評(píng)級(jí)可能反而增高。此外，孟慶霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)，囊胚形態(tài)學(xué)指標(biāo)并不能預(yù)測(cè)新生兒出生性別比，但樣本量較小，其活產(chǎn)僅277例。

本研究結(jié)果顯示，不管囊胚形態(tài)學(xué)如何，一旦活產(chǎn)，不良圍產(chǎn)兒結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)似乎并不會(huì)增加，包括LGA、SGA、FM、LBW和PTB。囊胚TE分級(jí)與子代性別比具有獨(dú)立相關(guān)性，新鮮周期中ICM分級(jí)為“B”的囊胚較“A”男性子代的比例明顯增加。但本研究同既往研究一樣對(duì)納入人群進(jìn)行了篩選，得出的結(jié)論針對(duì)的是特定人群，并且對(duì)性別比的研究來說樣本量過小，所以，在得出普遍結(jié)論之前，還需要更高質(zhì)量、更大樣本、更全面的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。

本研究作為單中心研究減少了不同中心促排卵方案、培養(yǎng)條件、囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分等方面的偏倚。由于臨床上囊胚移植往往選擇形態(tài)學(xué)等級(jí)較高的囊胚，納入的低級(jí)別囊胚數(shù)較少，且第7天囊胚、ICM分級(jí)為“C”的囊胚被評(píng)為不可利用胚胎，移植數(shù)量極少，并未納入最終的模型，可能造成結(jié)果的偏差，所以需要更全面的數(shù)據(jù)研究每個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)和新生兒結(jié)局的相關(guān)性。

預(yù)測(cè)胚胎移植后的結(jié)局是醫(yī)患普遍關(guān)注的問題，滋養(yǎng)外胚層活檢可以明顯提高植入率和活產(chǎn)率和降低流產(chǎn)率[29-30]，但囊胚活檢的成本較高且在中國臨床實(shí)踐中具有局限性。囊胚形態(tài)動(dòng)力學(xué)將延時(shí)成像技術(shù)整合到形態(tài)學(xué)評(píng)估中，可顯著提高妊娠率和活產(chǎn)率，并減少早期妊娠流產(chǎn)[31]。但多中心研究證明了當(dāng)不同的臨床醫(yī)生應(yīng)用這些模型時(shí)的局限性[32]，有關(guān)活產(chǎn)率的提高和在IVF實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施該技術(shù)的成本效益的證據(jù)受到質(zhì)疑。沈彥軍等利用列線圖開發(fā)復(fù)蘇周期單囊胚移植的臨床妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)模型是對(duì)輔助生殖臨床預(yù)測(cè)模型領(lǐng)域的一項(xiàng)嘗試[33]，但其納入變量不完整，仍缺乏有效性的驗(yàn)證。

染色體異常對(duì)胚胎或胎兒常具有致死效應(yīng)，因此理論上進(jìn)行染色體異常的篩選可以獲取高妊娠潛能的胚胎。囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與胚胎倍性顯著相關(guān)[23,34]，而且形態(tài)學(xué)評(píng)估過程不損傷胚胎、簡(jiǎn)單快捷、對(duì)設(shè)備要求低，臨床上可通過囊胚形態(tài)學(xué)指標(biāo)為臨床囊胚移植的選擇提供參考依據(jù)。然而，由于囊胚移植的歷史較短，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分是否影響子代壽命和子代遠(yuǎn)期的安全性仍需進(jìn)一步探索。