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        膠原蛋白相關(guān)基因COL15A1多態(tài)性與盆腔器官脫垂的關(guān)聯(lián)研究*

        2021-11-17 03:13:54蕾,楊華,朱
        關(guān)鍵詞:膠原校正多態(tài)性

        李 蕾,楊 華,朱 蘭

        (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科 國(guó)家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心,北京 100730)

        盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)是由盆底肌肉、結(jié)締組織和神經(jīng)等所構(gòu)成的盆底支撐系統(tǒng)功能受損,不能很好地承托盆腔各器官,造成子宮、膀胱、直腸等出現(xiàn)向下移位。盡管POP會(huì)影響所有年齡段的女性,但更常見于中老年婦女,極大地影響了女性的生活質(zhì)量[1]。最新中國(guó)成年女性POP流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明,我國(guó)成年女性有癥狀性POP(≥POP-Q Ⅱ)的患病率為9.56%[2],絕經(jīng)后為15%[3]。目前,重度及復(fù)發(fā)的POP以手術(shù)治療為主,女性經(jīng)歷POP手術(shù)的終生風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)19%[4],其中30%患者在手術(shù)成功后仍需再次手術(shù)治療[5],是臨床上不可忽視并難以解決的問題。目前的證據(jù)表明,遺傳和環(huán)境因素都會(huì)導(dǎo)致POP。最常見的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)、胎次和慢性腹內(nèi)壓力增加等,而遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素則包括種族/民族、POP家族史、馬凡綜合征或埃勒斯-丹洛斯綜合征等[1]。然而,POP的遺傳易感性仍有待闡明。

        盆底支撐系統(tǒng)對(duì)于保持盆腔器官的正常解剖位置至關(guān)重要。某些危險(xiǎn)因素會(huì)影響盆底結(jié)締組織、肌肉和神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能,從而引發(fā)POP[6]。膠原纖維是結(jié)締組織的主要成分,膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、含量和比例的變化可導(dǎo)致盆底結(jié)締組織支撐系統(tǒng)力學(xué)性質(zhì)的變化,從而導(dǎo)致POP的發(fā)生和發(fā)展[7]。對(duì)POP遺傳易感性的研究可能有助于識(shí)別這種疾病的高危婦女,并以期改進(jìn)其預(yù)防和治療策略。研究表明,編碼膠原蛋白、彈性蛋白和層黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程的相關(guān)基因具有遺傳多態(tài)性,與POP的發(fā)生顯著關(guān)聯(lián)[8-9]。本課題組前期工作還篩選了編碼膠原蛋白亞基COL3A1、COL1A1、COL18A1、COL14A1和COL5A1等基因作為可能的候選基因[10],然而COL15A1是否是重度脫垂的潛在候選基因仍未知。本研究中,在中國(guó)女性病例對(duì)照關(guān)聯(lián)研究中使用Illumina測(cè)序平臺(tái)的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序的方法對(duì)COL15A1基因進(jìn)行分析,并確定COL15A1中的基因多態(tài)性是否與重度POP相關(guān)。

        1 材料與方法

        1.1 樣本來源 采用病例對(duì)照關(guān)聯(lián)研究,病例組為于北京協(xié)和醫(yī)院就診且根據(jù)盆腔器官脫垂量化系統(tǒng)(POP-Q)分期為Ⅲ度和Ⅳ度脫垂的患者,對(duì)照組為無脫垂(0度)和既往無脫垂手術(shù)史的患者。參與者均簽署知情同意書,研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除患有結(jié)締組織疾病,包括馬凡綜合征、埃勒斯-丹洛斯綜合征等,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或硬皮病,以及患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病如中風(fēng)等的婦女。由于不同種族/民族之間的遺傳變異不同,所有樣本均限于中國(guó)漢民族血統(tǒng)。招募48例病例組和48例對(duì)照組患者進(jìn)行基因分型?;颊叩呐R床統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)在本課題組前期研究中進(jìn)行了總結(jié)[8,10]。

        1.2 基因分型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)選擇和分析 從外周靜脈全血樣品中分離出DNA(Qiagen血液DNA提取試劑盒),利用安捷倫液體捕獲系統(tǒng)(Agilent SureSelect Custom Kit),使用1~2μg DNA在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)進(jìn)行雙尾末端測(cè)序,在每個(gè)樣品的靶基因區(qū)域上提供200×以上的平均覆蓋率(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。因此能對(duì)COL15A1基因進(jìn)行綜合評(píng)估?;趨⒖蓟蚪M(UCSC hg19)的BWA軟件將有效的測(cè)序數(shù)據(jù)導(dǎo)入BAM文件。使用Samtools和Picard(http://broadinstitute.github.io/picard)對(duì)文件進(jìn)行排序并標(biāo)記重復(fù)讀取。Samtools mpileup和bcftools軟件用于調(diào)用變體、插入和刪除。保留次等位基因頻率(MAF)>5%的變異。使用ANNOVAR提供等位基因的位置、類型和保守預(yù)測(cè)等信息。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用未校正模型和校正模型來研究基因的SNP位點(diǎn)與POP的關(guān)系。由于病例組和對(duì)照組的妊娠和分娩兩個(gè)變量不匹配,同時(shí)對(duì)此多變量模型進(jìn)行校正。未經(jīng)校正的模型采用Fisher精確檢驗(yàn),校正模型使用PLINK軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。給出變異位點(diǎn)的比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)。其中OR<1提示該位點(diǎn)變異有保護(hù)作用,OR>1時(shí)有風(fēng)險(xiǎn)作用。P<0.05被認(rèn)為是顯著的,P<0.1被認(rèn)為是臨界顯著的?;蚪Y(jié)構(gòu)示意圖顯示外顯子和內(nèi)含子及SNP類型,由外顯子-內(nèi)含子圖形生成器繪制(http://wormweb.org/exonintron)。使用Haploview軟件繪制SNPs間r2的連鎖不平衡(LD)圖。

        2 結(jié) 果

        2.1 臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 病例組和對(duì)照組的平均年齡[(61.85±10.66)歲 vs (62.73±8.88)歲,P=0.663]和體質(zhì)量指數(shù)[(25.11±3.83)kg/m2vs (24.52±3.48)kg/m2,P=0.434]比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組幾乎比對(duì)照組多一次分娩(2.35±1.34 vs 1.58±1.06,P=0.005)和妊娠(3.60±1.89 vs 2.50±1.50,P=0.023)次數(shù)。因此妊娠和分娩兩個(gè)變量不匹配,需在分析中進(jìn)行校正。48例病例組中,41例婦女(85.42%)被診斷為POP-Q Ⅲ期,7例婦女(14.58%)被診斷為POP-Q Ⅳ期[8,10]。

        2.2COL15A1基因與POP之間的關(guān)聯(lián)研究 使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)COL15A1基因進(jìn)行測(cè)序,共檢測(cè)出11個(gè)SNP位點(diǎn)(圖1)。

        圖1 COL15A1基因結(jié)構(gòu)示意圖外顯子呈垂直線表示,候選SNP用箭頭標(biāo)記并以不同的顏色表示:外顯子(紅色)和內(nèi)含子(藍(lán)色)

        在未校正模型和校正模型中,COL15A1的SNP位點(diǎn)rs2297603與POP顯著相關(guān)(未校正模型:OR=0.44,95%CI為0.21~0.92,P=0.027;校正模型:OR=0.37,95%CI為0.17~0.83,P=0.016)。在校正模型中,rs2075663和rs7854112與POP之間趨向顯著相關(guān)(OR=1.80,95%CI為0.97~3.35,P=0.062;OR=1.79,95%CI為0.91~3.53,P=0.092)(表1)。其他位點(diǎn)和POP之間無顯著相關(guān)。

        表1 COL15A1基因多態(tài)性與POP的相關(guān)性

        2.3COL15A1基因多態(tài)性位點(diǎn)的注釋COL15A1基因位于9號(hào)染色體q22.33。其中rs2297603是一個(gè)錯(cuò)義突變的位點(diǎn),導(dǎo)致其氨基酸序列上第504位的甘氨酸變成纈氨酸。rs2075663是一個(gè)錯(cuò)義突變的位點(diǎn),導(dǎo)致其氨基酸序列上第204位的甲硫氨酸變成纈氨酸。rs7854112是一個(gè)同義突變位點(diǎn),沒有導(dǎo)致氨基酸序列的改變(表2)。

        表2 COL15A1基因多態(tài)性位點(diǎn)注釋

        連鎖不平衡分析表明,rs35934703與rs3739800之間有較好的連鎖不平衡值(r2=0.9),提示兩個(gè)位點(diǎn)連鎖程度較強(qiáng)。見圖2。

        圖2 COL15A1基因SNP位點(diǎn)的LD分析圖每個(gè)框中都有r2值,值越接近1.0,兩個(gè)SNP之間的相關(guān)性越高,沒有值的框表示完美的LD值(r2=1)

        3 討 論

        POP是由于盆底支持組織功能下降導(dǎo)致的一種常見的女性盆底疾病。研究表明,膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的合成與降解失衡對(duì)POP的發(fā)病起一定作用,并已開展許多胞外基質(zhì)相關(guān)基因的多態(tài)性與POP之間的關(guān)聯(lián)研究[11-12]。本病例對(duì)照關(guān)聯(lián)研究中,首次對(duì)編碼膠原鏈的COL15A1基因進(jìn)行了測(cè)序。病例組和對(duì)照組中,由于分娩和妊娠這兩個(gè)POP的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素不匹配,我們分別評(píng)估了在未校正模型和校正了分娩和妊娠兩個(gè)變量的模型中SNPs與POP的相關(guān)性,并提供初步的證據(jù)表明COL15A1可能是POP的潛在候選基因。

        COL15A1編碼XV型膠原的α鏈,XV型膠原在組織中分布廣泛,表達(dá)最強(qiáng)的部位位于基底膜區(qū),起到將基底膜黏附到下層結(jié)締組織基質(zhì)的作用[13]。COL15A1作為大纖維膠原的連接體,為膠原基質(zhì)提供結(jié)構(gòu)完整性。它的特征是一個(gè)高度中斷的膠原結(jié)構(gòu)域,兩側(cè)是大的球狀結(jié)構(gòu)域和附著的糖胺聚糖鏈,因此也被鑒定為硫酸軟骨素蛋白多糖[14]。XV型膠原能與基底膜和微纖維成分結(jié)合,包括層黏連蛋白、玻連蛋白和纖連蛋白等成分[15]。因此有學(xué)者認(rèn)為其可能在纖維膠原基質(zhì)和基底膜之間形成一座橋梁,重塑胞外基質(zhì),并可能作為“分子減震器”穩(wěn)定和增強(qiáng)抗壓和膨脹的彈性力量[16]。此外,蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的XV型膠原C末端片段restin,是一種與內(nèi)皮抑素密切相關(guān)的潛在抗血管生成蛋白[17]。

        已有研究表明,與對(duì)照組相比,POP患者陰道細(xì)胞COL15A1表達(dá)下降[18]。本研究發(fā)現(xiàn),rs2297603和POP之間存在顯著關(guān)聯(lián),它們可能對(duì)POP的發(fā)展具有保護(hù)作用。rs2297603是一個(gè)錯(cuò)義突變,可將氨基酸甘氨酸替換成纈氨酸,這種氨基酸變化可能會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。錯(cuò)義突變r(jià)s2075663和同義突變r(jià)s7854112與POP之間存在臨界顯著關(guān)聯(lián),它們可能是POP發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素。然而這些結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

        本研究的優(yōu)點(diǎn):以往的研究限制于某一候選基因的某些特定SNP位點(diǎn),檢測(cè)范圍非常有限。而本研究采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)COL15A1基因進(jìn)行測(cè)序,能檢測(cè)整個(gè)基因及其編碼區(qū),系統(tǒng)全面地評(píng)估COL15A1基因多態(tài)性與POP之間的關(guān)聯(lián)。此外,在這項(xiàng)候選基因研究中,本研究調(diào)查了無家族史的散發(fā)漢民族群體,從中國(guó)大陸招募了嚴(yán)格限制在POP-Q Ⅲ期和Ⅳ期的重度脫垂女性,這些嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)增加了發(fā)現(xiàn)致病變異的可靠性。

        在中國(guó)大陸進(jìn)行的全國(guó)性流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),POP-Q Ⅲ期和Ⅳ期的發(fā)生率為2.04%[2],這使得在一定時(shí)期內(nèi)很難招募大量重度脫垂的婦女。本研究樣本量相對(duì)較小,統(tǒng)計(jì)功效可能有限。盡管接受了最小等位基因大于5%的所有變異,但實(shí)際上檢測(cè)出的顯著或臨近顯著的變異的等位基因頻率比5%高得多。如果只考慮顯著相關(guān)的變異(等位基因頻率范圍為16.67%~58.33%),這樣得出的統(tǒng)計(jì)功效在一定程度上可使本研究的數(shù)據(jù)作為參考。今后需招募更多的女性,在其他與ECM代謝有關(guān)的候選基因中進(jìn)行大規(guī)模研究。

        綜上所述,本研究結(jié)果提供了初步的證據(jù)表明膠原鏈編碼基因COL15A1的多態(tài)性可能與POP有關(guān),今后還需進(jìn)行更多的驗(yàn)證。

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