李 蕾，楊 華，朱 蘭

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科 國家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心，北京 100730)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是由盆底肌肉、結(jié)締組織和神經(jīng)等所構(gòu)成的盆底支撐系統(tǒng)功能受損，不能很好地承托盆腔各器官，造成子宮、膀胱、直腸等出現(xiàn)向下移位。盡管POP會影響所有年齡段的女性，但更常見于中老年婦女，極大地影響了女性的生活質(zhì)量[1]。最新中國成年女性POP流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，我國成年女性有癥狀性POP(≥POP-Q Ⅱ)的患病率為9.56%[2]，絕經(jīng)后為15%[3]。目前，重度及復(fù)發(fā)的POP以手術(shù)治療為主，女性經(jīng)歷POP手術(shù)的終生風(fēng)險高達(dá)19%[4]，其中30%患者在手術(shù)成功后仍需再次手術(shù)治療[5]，是臨床上不可忽視并難以解決的問題。目前的證據(jù)表明，遺傳和環(huán)境因素都會導(dǎo)致POP。最常見的環(huán)境風(fēng)險因素包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)、胎次和慢性腹內(nèi)壓力增加等，而遺傳風(fēng)險因素則包括種族/民族、POP家族史、馬凡綜合征或埃勒斯-丹洛斯綜合征等[1]。然而，POP的遺傳易感性仍有待闡明。

盆底支撐系統(tǒng)對于保持盆腔器官的正常解剖位置至關(guān)重要。某些危險因素會影響盆底結(jié)締組織、肌肉和神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能，從而引發(fā)POP[6]。膠原纖維是結(jié)締組織的主要成分，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、含量和比例的變化可導(dǎo)致盆底結(jié)締組織支撐系統(tǒng)力學(xué)性質(zhì)的變化，從而導(dǎo)致POP的發(fā)生和發(fā)展[7]。對POP遺傳易感性的研究可能有助于識別這種疾病的高危婦女，并以期改進(jìn)其預(yù)防和治療策略。研究表明，編碼膠原蛋白、彈性蛋白和層黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程的相關(guān)基因具有遺傳多態(tài)性，與POP的發(fā)生顯著關(guān)聯(lián)[8-9]。本課題組前期工作還篩選了編碼膠原蛋白亞基COL3A1、COL1A1、COL18A1、COL14A1和COL5A1等基因作為可能的候選基因[10]，然而COL15A1是否是重度脫垂的潛在候選基因仍未知。本研究中，在中國女性病例對照關(guān)聯(lián)研究中使用Illumina測序平臺的目標(biāo)區(qū)域捕獲測序的方法對COL15A1基因進(jìn)行分析，并確定COL15A1中的基因多態(tài)性是否與重度POP相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 采用病例對照關(guān)聯(lián)研究，病例組為于北京協(xié)和醫(yī)院就診且根據(jù)盆腔器官脫垂量化系統(tǒng)(POP-Q)分期為Ⅲ度和Ⅳ度脫垂的患者，對照組為無脫垂(0度)和既往無脫垂手術(shù)史的患者。參與者均簽署知情同意書，研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。排除患有結(jié)締組織疾病，包括馬凡綜合征、埃勒斯-丹洛斯綜合征等，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或硬皮病，以及患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病如中風(fēng)等的婦女。由于不同種族/民族之間的遺傳變異不同，所有樣本均限于中國漢民族血統(tǒng)。招募48例病例組和48例對照組患者進(jìn)行基因分型。患者的臨床統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)在本課題組前期研究中進(jìn)行了總結(jié)[8,10]。

1.2 基因分型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)選擇和分析 從外周靜脈全血樣品中分離出DNA(Qiagen血液DNA提取試劑盒)，利用安捷倫液體捕獲系統(tǒng)(Agilent SureSelect Custom Kit)，使用1～2μg DNA在Illumina HiSeq 4000平臺進(jìn)行雙尾末端測序，在每個樣品的靶基因區(qū)域上提供200×以上的平均覆蓋率(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。因此能對COL15A1基因進(jìn)行綜合評估。基于參考基因組(UCSC hg19)的BWA軟件將有效的測序數(shù)據(jù)導(dǎo)入BAM文件。使用Samtools和Picard(http://broadinstitute.github.io/picard)對文件進(jìn)行排序并標(biāo)記重復(fù)讀取。Samtools mpileup和bcftools軟件用于調(diào)用變體、插入和刪除。保留次等位基因頻率(MAF)>5%的變異。使用ANNOVAR提供等位基因的位置、類型和保守預(yù)測等信息。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用未校正模型和校正模型來研究基因的SNP位點與POP的關(guān)系。由于病例組和對照組的妊娠和分娩兩個變量不匹配，同時對此多變量模型進(jìn)行校正。未經(jīng)校正的模型采用Fisher精確檢驗，校正模型使用PLINK軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。給出變異位點的比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)。其中OR<1提示該位點變異有保護(hù)作用，OR>1時有風(fēng)險作用。P<0.05被認(rèn)為是顯著的，P<0.1被認(rèn)為是臨界顯著的?；蚪Y(jié)構(gòu)示意圖顯示外顯子和內(nèi)含子及SNP類型，由外顯子-內(nèi)含子圖形生成器繪制(http://wormweb.org/exonintron)。使用Haploview軟件繪制SNPs間r2的連鎖不平衡(LD)圖。

2 結(jié) 果

2.1 臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計 病例組和對照組的平均年齡[(61.85±10.66)歲 vs (62.73±8.88)歲，P=0.663]和體質(zhì)量指數(shù)[(25.11±3.83)kg/m2vs (24.52±3.48)kg/m2，P=0.434]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病例組幾乎比對照組多一次分娩(2.35±1.34 vs 1.58±1.06，P=0.005)和妊娠(3.60±1.89 vs 2.50±1.50，P=0.023)次數(shù)。因此妊娠和分娩兩個變量不匹配，需在分析中進(jìn)行校正。48例病例組中，41例婦女(85.42%)被診斷為POP-Q Ⅲ期，7例婦女(14.58%)被診斷為POP-Q Ⅳ期[8,10]。

2.2COL15A1基因與POP之間的關(guān)聯(lián)研究 使用Illumina測序平臺對COL15A1基因進(jìn)行測序，共檢測出11個SNP位點(圖1)。

圖1 COL15A1基因結(jié)構(gòu)示意圖外顯子呈垂直線表示，候選SNP用箭頭標(biāo)記并以不同的顏色表示：外顯子(紅色)和內(nèi)含子(藍(lán)色)

在未校正模型和校正模型中，COL15A1的SNP位點rs2297603與POP顯著相關(guān)(未校正模型：OR=0.44，95%CI為0.21～0.92，P=0.027；校正模型：OR=0.37，95%CI為0.17～0.83，P=0.016)。在校正模型中，rs2075663和rs7854112與POP之間趨向顯著相關(guān)(OR=1.80，95%CI為0.97～3.35，P=0.062；OR=1.79，95%CI為0.91～3.53，P=0.092)(表1)。其他位點和POP之間無顯著相關(guān)。

表1 COL15A1基因多態(tài)性與POP的相關(guān)性

2.3COL15A1基因多態(tài)性位點的注釋COL15A1基因位于9號染色體q22.33。其中rs2297603是一個錯義突變的位點，導(dǎo)致其氨基酸序列上第504位的甘氨酸變成纈氨酸。rs2075663是一個錯義突變的位點，導(dǎo)致其氨基酸序列上第204位的甲硫氨酸變成纈氨酸。rs7854112是一個同義突變位點，沒有導(dǎo)致氨基酸序列的改變(表2)。

表2 COL15A1基因多態(tài)性位點注釋

連鎖不平衡分析表明,rs35934703與rs3739800之間有較好的連鎖不平衡值(r2=0.9)，提示兩個位點連鎖程度較強(qiáng)。見圖2。

圖2 COL15A1基因SNP位點的LD分析圖每個框中都有r2值，值越接近1.0，兩個SNP之間的相關(guān)性越高，沒有值的框表示完美的LD值(r2=1)

3 討 論

POP是由于盆底支持組織功能下降導(dǎo)致的一種常見的女性盆底疾病。研究表明，膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的合成與降解失衡對POP的發(fā)病起一定作用，并已開展許多胞外基質(zhì)相關(guān)基因的多態(tài)性與POP之間的關(guān)聯(lián)研究[11-12]。本病例對照關(guān)聯(lián)研究中，首次對編碼膠原鏈的COL15A1基因進(jìn)行了測序。病例組和對照組中，由于分娩和妊娠這兩個POP的關(guān)鍵危險因素不匹配，我們分別評估了在未校正模型和校正了分娩和妊娠兩個變量的模型中SNPs與POP的相關(guān)性，并提供初步的證據(jù)表明COL15A1可能是POP的潛在候選基因。

COL15A1編碼XV型膠原的α鏈，XV型膠原在組織中分布廣泛，表達(dá)最強(qiáng)的部位位于基底膜區(qū)，起到將基底膜黏附到下層結(jié)締組織基質(zhì)的作用[13]。COL15A1作為大纖維膠原的連接體，為膠原基質(zhì)提供結(jié)構(gòu)完整性。它的特征是一個高度中斷的膠原結(jié)構(gòu)域，兩側(cè)是大的球狀結(jié)構(gòu)域和附著的糖胺聚糖鏈，因此也被鑒定為硫酸軟骨素蛋白多糖[14]。XV型膠原能與基底膜和微纖維成分結(jié)合，包括層黏連蛋白、玻連蛋白和纖連蛋白等成分[15]。因此有學(xué)者認(rèn)為其可能在纖維膠原基質(zhì)和基底膜之間形成一座橋梁，重塑胞外基質(zhì)，并可能作為“分子減震器”穩(wěn)定和增強(qiáng)抗壓和膨脹的彈性力量[16]。此外，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的XV型膠原C末端片段restin，是一種與內(nèi)皮抑素密切相關(guān)的潛在抗血管生成蛋白[17]。

已有研究表明，與對照組相比，POP患者陰道細(xì)胞COL15A1表達(dá)下降[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs2297603和POP之間存在顯著關(guān)聯(lián)，它們可能對POP的發(fā)展具有保護(hù)作用。rs2297603是一個錯義突變，可將氨基酸甘氨酸替換成纈氨酸，這種氨基酸變化可能會引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。錯義突變rs2075663和同義突變rs7854112與POP之間存在臨界顯著關(guān)聯(lián)，它們可能是POP發(fā)展的風(fēng)險因素。然而這些結(jié)果還需進(jìn)一步驗證。

本研究的優(yōu)點：以往的研究限制于某一候選基因的某些特定SNP位點，檢測范圍非常有限。而本研究采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測序技術(shù)對COL15A1基因進(jìn)行測序，能檢測整個基因及其編碼區(qū)，系統(tǒng)全面地評估COL15A1基因多態(tài)性與POP之間的關(guān)聯(lián)。此外，在這項候選基因研究中，本研究調(diào)查了無家族史的散發(fā)漢民族群體，從中國大陸招募了嚴(yán)格限制在POP-Q Ⅲ期和Ⅳ期的重度脫垂女性，這些嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)增加了發(fā)現(xiàn)致病變異的可靠性。

在中國大陸進(jìn)行的全國性流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，POP-Q Ⅲ期和Ⅳ期的發(fā)生率為2.04%[2]，這使得在一定時期內(nèi)很難招募大量重度脫垂的婦女。本研究樣本量相對較小，統(tǒng)計功效可能有限。盡管接受了最小等位基因大于5%的所有變異，但實際上檢測出的顯著或臨近顯著的變異的等位基因頻率比5%高得多。如果只考慮顯著相關(guān)的變異(等位基因頻率范圍為16.67%～58.33%)，這樣得出的統(tǒng)計功效在一定程度上可使本研究的數(shù)據(jù)作為參考。今后需招募更多的女性,在其他與ECM代謝有關(guān)的候選基因中進(jìn)行大規(guī)模研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提供了初步的證據(jù)表明膠原鏈編碼基因COL15A1的多態(tài)性可能與POP有關(guān)，今后還需進(jìn)行更多的驗證。