○楊移斌

隨著養(yǎng)殖戶對高產(chǎn)、高效的追求，水生動物養(yǎng)殖密度日益提高，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化。水生動物疾病頻發(fā)，這些疾病中或多或少都有病原生物的參與。因此，在養(yǎng)殖動物病害防控進行相關(guān)藥敏實驗是必要的，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)中推廣藥敏實驗也遇到了一些問題。本文就水生動物病原藥敏實驗進行闡述，以期與同行交流。

1 何為藥敏實驗

藥敏試驗是離體抗微生物藥物敏感性試驗的簡稱，又稱藥物敏感性試驗，是指在離體條件下，測定藥物抑制或殺滅致病微生物能力的試驗。藥物敏感性實驗實驗簡（稱藥敏實驗，）涉及到病原體及藥物兩方面，因此病原體必須是可體外培養(yǎng)的，可分離的，而藥物目前常用抗生素都有市售藥敏紙片供選擇，而針對其他藥物如消毒劑等，則可進行相應(yīng)的MIC（最小抑菌濃度）/MBC（最小殺菌濃度）測定，從而評估病原體對其敏感性。目前可以進行藥敏實驗的病原只有細菌、真菌以及一些寄生蟲（寄生蟲的藥敏實驗主要以活蟲體在藥物刺激下掙扎程度來反應(yīng)的）。

2 藥敏實驗方法

目前藥敏實驗主要分為瓊脂擴散法（即K-B法）及倍比稀釋法，而瓊脂擴散法又分為打孔法及藥敏紙片法。一般以藥敏紙片法及倍比稀釋法最常用。以細菌性病原為例，簡介藥敏實驗方法。

無菌條件下，取患瀕死水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，取病灶及重要組織器官如肝腎脾等，用接種環(huán)蘸取所取各樣品在固體培養(yǎng)基上劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。從已經(jīng)長好菌落的平板上挑取形態(tài)大小、顏色相近的菌落進一步純化培養(yǎng)。向分離得到的純化菌株加入25%甘油，混勻后保存于-80℃冷凍保存。

藥敏紙片法：將分離株接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)200r/min恒溫28℃震蕩培養(yǎng)18小時，用無菌生理鹽水調(diào)整分離株濃度為104-108CFU/mL，取100μL菌液均勻涂布于固體瓊脂培養(yǎng)基上，貼上不同種類的藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24小時后測量抑菌直徑，根據(jù)藥敏紙片說明書者其他標(biāo)準(zhǔn)判定分離株對不同藥物的敏感性。

倍比稀釋法：主要是通過使用液體培養(yǎng)基倍比稀釋藥物，然后在每個濃度藥物內(nèi)接種病原，恒溫培養(yǎng)24小時后，把無菌生長、稀釋度最大的藥物如消毒劑濃度作為分離株的MIC，取所有無菌生長的組涂布于固體培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)24小時后觀察有無菌落生長，平板上無菌落生長的最低藥物如消毒劑濃度即為MBC。

圖1 藥敏實驗-K-B法

圖2 藥敏實驗-倍比稀釋法

3 實際生產(chǎn)中可選用的藥敏實驗方法

在實際生產(chǎn)中由于條件限制以及病情的緊迫性，使得藥敏實驗不太可能像在實驗室這么開展，因此制定生產(chǎn)中藥敏實驗方法顯得更加迫切，下面將就生產(chǎn)中可行的藥敏實驗方法進行詳細闡述。

首先針對發(fā)病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物進行取樣，同樣是選擇具有典型癥狀瀕死的個體。在無菌條件下，取其病灶部位及重要組織器官。將所取樣品分別剪碎，溶解于無菌0.9%生理鹽水中，后涂布于固體平板上，或者接種含有不同濃度藥物試管中，其后操作同K-B或者倍比稀釋法，經(jīng)恒溫24小時培養(yǎng)后即可讀取結(jié)果。

4 藥敏實驗結(jié)果解讀

倍比稀釋法得出的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度即可作為用藥依據(jù)。K-B法結(jié)果得到的是抑菌圈的直徑大小，一般購買的商品化藥敏紙片都有抑菌圈參考范圍，這抑菌圈參考范圍即是使用標(biāo)準(zhǔn)菌株得出的實驗數(shù)據(jù)，依據(jù)說明書即可判定是否耐藥，根據(jù)結(jié)果也可作為用藥依據(jù)。在實際生產(chǎn)中，如果自制藥敏紙片，則需先用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行實驗，得出參考范圍，如多大抑菌圈算敏感等，再以此為參考判定所分離菌株的藥物敏感性。絕對不可以統(tǒng)一確定一個數(shù)值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，如確定10mm分標(biāo)準(zhǔn)，大于10mm為敏感，小于或等于為耐藥或者中度敏感，這是不合理的，因為不同藥物抑菌機制是不一樣的。

5 藥敏實驗的意義

對于漁藥生產(chǎn)企業(yè)而言，“藥敏實驗室”除了能幫助企業(yè)把控漁藥原材料的質(zhì)量外，還能通過對所生產(chǎn)漁藥的應(yīng)用效果進行試驗研究，根據(jù)漁藥的實際用藥效果修訂其漁藥的使用說明書內(nèi)容，確保漁藥的應(yīng)用效果，避免藥害事故發(fā)生。首先，在“藥敏實驗室”根據(jù)漁藥的類型和功能，進行藥效驗證性試驗。針對抗生素類漁藥除了在實驗室內(nèi)測定其對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病菌的最小抑菌濃度（MIC）外，還需要完成在野外魚池中的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌性疾病治療試驗；對于水產(chǎn)用消毒劑要完成測定其對水養(yǎng)殖水體中細菌或者水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病菌的殺菌效果；對水產(chǎn)用殺蟲劑測定對水生動物寄生蟲的驅(qū)、殺蟲效果。其次，對于水產(chǎn)用消毒劑和殺蟲藥物，還需要完成水體環(huán)境因子（如水溫、pH等）對藥物效果影響的相關(guān)試驗，準(zhǔn)確地掌握漁藥在不同水體環(huán)境因子存在時對漁藥使用效果的影響，這些試驗內(nèi)容對于避免漁藥的用藥事故發(fā)生，都是至關(guān)重要的。

對于漁藥經(jīng)銷人員而言，可以利用“藥敏實驗室”對所銷售漁藥完成水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病生物的抑菌、殺菌、殺蟲效果試驗，幫助其準(zhǔn)確掌握所銷售漁藥的質(zhì)量與使用效果，科學(xué)地指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者使用所銷售的漁藥：首先，在“藥敏實驗室”根據(jù)漁藥的類型和功能，進行不同種類漁藥用藥效果的驗證性試驗。針對抗生素類漁藥主要是測定其對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病菌的最小抑菌濃度（MIC），對于水產(chǎn)用消毒劑主要是測定其對水養(yǎng)殖水體中細菌或者水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病菌的殺菌效果，而對于水產(chǎn)用殺蟲劑測定對水生動物寄生蟲的驅(qū)、殺蟲效果。其次，根據(jù)在“藥敏實驗室”完成的藥物效果試驗結(jié)果，準(zhǔn)確地掌握所銷售的漁藥質(zhì)量與使用效果，做到對漁藥質(zhì)量和使用效果的心中有數(shù)。其三，根據(jù)在“藥敏實驗室”獲得的漁藥藥效試驗結(jié)果，指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者科學(xué)、合理地使用各種漁藥，以提高漁藥使用效果，實現(xiàn)科學(xué)用藥并能達成農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提倡的“減量用藥”的目標(biāo)。

對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者而言，“藥敏實驗室”可以幫助解決在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病防控中的一些問題：首先，“藥敏實驗室”可以通過分離、鑒定病原生物，幫助水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者解決水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病正確診斷的問題。其次，“藥敏實驗室”可以通過市售漁藥對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病生物的抑菌、殺菌、殺蟲效果試驗，幫助水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者將解決從漁藥市場上正確選擇、購買漁藥的問題。其三，“藥敏實驗室”可以通過測定漁藥對致病生物的最小抑、殺菌濃度試驗，幫助水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者解決無法準(zhǔn)確確定漁藥使用劑量的問題（引自陳昌福教授，闡述的很完美）。

6 藥敏實驗結(jié)果不等于臨床防控效果

使用抗生素應(yīng)以細菌藥敏實驗結(jié)果為依據(jù)，但臨床對此往往并不重視，原因是細菌的藥敏結(jié)果與臨床藥效出入較大，有時甚至出現(xiàn)用敏感藥無效，而用不敏感藥有效的情況。究其原因很復(fù)雜，主要有如下幾個方面:

6.1 體內(nèi)外環(huán)境不同

體外藥敏試驗和體內(nèi)藥物療效確實有差異，主要是因為體外和體內(nèi)的環(huán)境不同，有些細菌可以利用體內(nèi)的一些物質(zhì)生成抵抗抗生素的成分，使抗生素失效，導(dǎo)致出現(xiàn)體外敏感，而體內(nèi)耐藥的情況。更重要一點即是體外，病原微生物直接跟藥物接觸，而體內(nèi)，藥物跟病原微生物接觸需要經(jīng)過用藥、吸收、運載及達峰等一系列步驟，每一步都會對藥效產(chǎn)生很大的影響。

6.2 細菌耐藥性產(chǎn)生

一些細菌產(chǎn)生耐藥性。例如產(chǎn)超廣譜B2內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌和克雷伯菌對頭孢菌素及氨曲南，沙門氏、志賀氏菌對第1、2代頭孢菌素及氨基糖苷類藥物的體外藥敏試驗有時可能呈敏感，但臨床治療是無效的，報告藥敏結(jié)果時需要對此類結(jié)果進行修正和說明。

6.3 致病菌判斷不準(zhǔn)確或未檢出

致病菌判斷不正確，或者沒有檢出，我們認(rèn)為這才是最可能原因。首先，一般醫(yī)院檢驗科微生物實驗室做細菌培養(yǎng)僅限于需氧非苛養(yǎng)菌的檢測，而對于厭氧菌、L型細菌以及一些對氧或營養(yǎng)有特殊要求的細菌都不能培養(yǎng)出來，如果這類細菌才是病原菌的話，當(dāng)然有問題了。致病菌的判定是個難題，需要檢驗者具備較豐富的經(jīng)驗，致病菌判斷錯誤，藥敏與藥效不符也就難免了。還有很多細菌可能都是致死或者產(chǎn)生癥狀，但根源可能是非生物因素，這樣可能會導(dǎo)致疾病反復(fù)暴發(fā)。

6.4 藥敏試驗方法選擇錯誤導(dǎo)致藥敏結(jié)果不正確

例如，非腸桿菌科革蘭氏陰性桿菌除銅綠假單胞菌和不動桿菌可做紙片擴散法藥敏試驗外，假單胞菌屬其它細菌、嗜麥芽窄食單胞菌和其它苛養(yǎng)不發(fā)酵葡萄糖的革蘭氏陰性桿菌的藥敏試驗均需用稀釋法。

6.5 藥敏紙片或藥物濃度變化或失效，造成假耐藥情況

這主要是試劑質(zhì)量問題，最容易出問題的是氨芐西林、替卡西林、哌拉西林紙片和亞胺硫霉素水劑，還有就是自制藥敏紙片質(zhì)量問題，如含量差異。

6.6 藥敏實驗操作誤差

嚴(yán)格按要求做藥敏試驗也是很重要的，包括選用合格的平皿、瓊脂、培養(yǎng)基的厚度、菌液的濁度、孵育的溫度及時間等。

6.7 漁藥質(zhì)量不合格

漁藥本身質(zhì)量問題，如購買到假冒偽劣產(chǎn)品等；漁藥保存不當(dāng)，養(yǎng)殖戶經(jīng)常把漁用物資存放在養(yǎng)殖池塘旁邊，極易受潮變質(zhì)；漁藥購買時間太久，導(dǎo)致過期等，而養(yǎng)殖戶又不舍得丟掉，總抱著僥幸心理使用，導(dǎo)致得不償失。

6.8 臨床用藥劑量很難把控

水生動物用藥方式與陸生動物絕然不同，水生動物一般都是群體用藥，采取的是潑灑或者伴餌投喂等方式，其最大的缺點即是無法確保發(fā)病個體能獲得足夠藥物。臨床用藥時劑量的很不好掌握，依據(jù)藥物說明書上的劑量，往往在使用過程中會出現(xiàn)很大損耗，如拌料損耗、藥性失活等，而藥物進入水環(huán)境，也會因為水質(zhì)的原因有不同的損耗，就不用水質(zhì)溶解藥物的量不一樣的，這給用藥劑量的確定帶來了很大的困難，目前尚無此類研究來解決這個問題。

6.9 藥物選擇、癥狀及使用對象不符

目前水生動物養(yǎng)殖中批準(zhǔn)使用的抗菌藥物種類不多，但各種藥物也有其應(yīng)用的范圍，即應(yīng)對癥、對魚選用藥物。如腸道疾病如炎癥等，則應(yīng)選擇在腸道停留較長的藥物如新霉素等，而治療全身性感染，則應(yīng)選擇吸收較好的氟苯尼考等。很多養(yǎng)殖對象對藥物的敏感性不用，藥物選擇不對不但不能致病，反而可能引起魚類死亡。

（通聯(lián)：430223，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 電話：17771809619）