汪增秀 吳衛(wèi)鋒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院) 肝病一科，江蘇 南京 210003)

肝癌是中老年人群的高發(fā)惡性腫瘤之一〔1〕。隨著我國人口老齡化比例不斷增長，肝癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已位居各類癌癥的第3位〔2〕。目前肝癌的臨床治療以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，但療效不佳，難以耐受藥物的毒副作用是影響預(yù)后的主要原因之一〔3〕。探尋具有明確療效的中草藥，對降低肝癌治療過程中的毒副反應(yīng)，延長患者生存時間，提升術(shù)后生存質(zhì)量具有重要意義〔4〕。白花蛇舌草屬一年生披散草本，為臨床常用中草藥，其成藥具有清熱解毒、利尿除濕的功效〔5〕。目前從白花蛇舌草中已提取、分離出30余種化合物，包括萜類、黃酮類、多糖類等〔6〕；具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化等多種活性，其中抗腫瘤作用被廣泛關(guān)注〔7〕。近年來對白花蛇舌草抗腫瘤的研究雖然廣泛，但仍缺少對其單體活性化合物的深入研究〔8〕。2-羥基-3-甲基蒽醌(HMA)是從白花蛇舌草中提取得到的一種蒽醌單體化合物，具有抗腫瘤活性〔9〕。本研究通過體外細胞學(xué)實驗觀察HMA對人肝癌細胞株HepG2增殖、凋亡的影響，并進一步探討白細胞介素(IL)-6/STAT3信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人肝癌細胞株HepG2購于深圳市百恩維生物科技有限公司；HMA購于西安千草生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶購于上海素爾生物科技有限公司；CCK8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購于上?？道噬锟萍加邢薰?；Trizol試劑，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京利維平生物科技有限公司；鼠抗人信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3、磷酸化(p)-Stat3、β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗購于杭州啟泰生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及增殖情況檢測 將HepG2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育至細胞融合度>80%，使用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。按1×106個/孔將細胞接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后分為空白對照組、50 μmol/L HMA組、100 μmol/L HMA組、200 μmol/L HMA組、20 ng/ml IL-6組、IL-6+HMA組，其中IL-6+HMA組為終濃度為50、100、200 μmol/L的HMA分別于20 ng/ml IL-6混合。上述各組均設(shè)置5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、36 h、48 h后使用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3細胞凋亡水平檢測 按1×106個/孔的密度將細胞接種于6孔板中，分組同1.2.1，每孔加入對應(yīng)的含藥培養(yǎng)基作用 48 h，收集培養(yǎng)基中的全部細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌，2 000 r/min離心10 min，收集細胞沉淀，使用膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC結(jié)合液重懸細胞，并設(shè)置全陰管、單陽管，混合均勻后室溫下避光靜置15～30 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4RT-PCR檢測 按1×106個/孔的密度將細胞接種于6孔板中，分組同1.2.1，每孔加入對應(yīng)的含藥培養(yǎng)基作用 48 h，Trizol法提取細胞總RNA，使用核酸蛋白分析儀測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。B淋巴細胞瘤(BCL)-2、凋亡相關(guān)基因(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)-9引物由上海云序生物科技有限公司設(shè)計合成，BCL-2引物序列：上游5′-GGTGTGTGTACTGGGGTGG-3′，下游5′-CCTACTGACTCATGGACTTGGC-3′；Bax引物序列：上游5′-GAGCCTTTTT CTGGAGAGCCC-3′，下游5′-TAGTCTTGGTAGTACCCG ACC-3′；Caspase-9引物序列：上游5′-GGACAATCAAGCGTCTTTGCTTC-3′，下游5′-TTTGGAATGG GGTCACCACG-3′；β-actin引物序列：上游5′-TCAGATCTCGTTGTATCGTG-3′，下游5′-CCATACCTTAGGACACCGTA-3′。PCR循環(huán)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s， 58℃ 30 s，40個循環(huán)，行溶解曲線分析，2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。

1.5Western印跡檢測 RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，BCA法蛋白定量，取20 μg蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離得到的蛋白條帶電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜后加入鼠抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)，鼠抗人p-STAT3單克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶2 000)，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫搖床孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用Image進行灰度分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HMA對HepG2細胞增殖的影響 培養(yǎng)24 h、36 h、48 h后，不同濃度HMA組HepG2細胞增殖水平均明顯低于空白對照組(P<0.05)，且隨著HMA濃度的增加對HepG2細胞增殖的抑制作用逐漸加強。見表1。

表1 各組培養(yǎng)不同時間HepG2細胞增殖水平比較

2.2IL-6在HMA抗肝癌中的作用分析 培養(yǎng)24 h、36 h、48 h后，IL-6組HepG2細胞增殖水平明顯高于空白對照組(P<0.05)；IL-6+50 μmol/L HMA組、IL-6+100 μmol/L HMA組、IL-6+200 μmol/L HMA組HepG2細胞增殖水平明顯低于IL-6組和空白對照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組培養(yǎng)不同時間HepG2細胞增殖水平及Bcl-2、Bax、Caspase-9 mRNA相對表達比較

2.3HMA對HepG2細胞凋亡的影響 空白對照組、IL-6組、IL-6+50 μmol/L HMA組、IL-6+100 μmol/L HMA組、IL-6+200 μmol/L HMA組HepG2細胞凋亡率分別為(21.53±0.66)%、(16.37±0.43)%、(43.19±0.95)%、(61.72±0.58)%、(63.05±0.83)%。IL-6組細胞凋亡率明顯低于空白對照組(P<0.05)；IL-6+50μmol/L HMA組、IL-6+100 μmol/L HMA組、IL-6+200 μmol/L HMA組HepG2細胞凋亡率明顯高于空白對照組和IL-6組(P<0.05)，且隨HMA濃度的提升明顯增加，提示HMA可促進HepG2細胞的凋亡。

2.4HMA對HepG2細胞BCL-2、Bax、Caspase-9 mRNA表達的影響 IL-6組Bax和Caspase-9 mRNA表達水平明顯低于空白對照組(P<0.05)；而HMA作用于HepG2細胞后可明逆轉(zhuǎn)IL-6對Bax、Caspase-9 mRNA表達的抑制效應(yīng)，其中IL-6+50 μmol/L HMA組、IL-6+100 μmol/L HMA組、IL-6+200 μmol/L HMA組Bax、Caspase-9 mRNA表達水平明顯高于IL-6組和空白對照組(P<0.05)。IL-6組抗凋亡基因BCL-2表達雖然高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；IL-6+50 μmol/L HMA組、IL-6+100 μmol/L HMA組、IL-6+200 μmol/L HMA組BCL-2表達明顯低于IL-6組和空白對照組(P<0.05)。見表2。

2.5HMA對HepG2細胞IL-6/STAT3信號通路的影響 IL-6組HepG2細胞中p-STAT3蛋白表達水平明顯高于空白對照組(P<0.05)；IL-6+50 μmol/L HMA組、IL-6+100 μmol/L HMA組、IL-6+200 μmol/L HMA組p-STAT3蛋白表達水平明顯低于IL-6組和空白對照組(P<0.05)。STAT3蛋白表達水平在各組患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表3。

1～5：空白對照組，IL-6組，IL-6+50 μmol/L HMA組，IL-6+100 μmol/L HMA組，IL-6+200 μmol/L HMA組圖1 各組STAT3、p-STAT3蛋白表達的Western印跡電泳

表3 HMA對HepG2細胞IL-6/STAT3信號通路的影響

3 討 論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，年發(fā)病患者數(shù)超過80萬且呈上升趨勢，已位居我國居民惡性腫瘤發(fā)病率的第3位〔10〕。肝癌具有病情發(fā)展迅速、惡性程度高、預(yù)后差的特點〔11〕；手術(shù)是目前最有效的治療方案，但多數(shù)患者確診時已處于晚期，失去了手術(shù)的機會〔12〕；同時肝癌患者放化療的并發(fā)癥較多且復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，因此臨床仍缺少理想的治療手段〔13〕。HMA可有效抑制乳腺癌、食管癌等細胞的體外增殖，且具有濃度依賴性〔14,15〕。本研究中50、100、200 μmol/L的HMA均能用明顯抑制肝癌HepG2細胞的增殖，且隨濃度的增加抑制程度逐漸上升。IL-6是多種細胞分泌產(chǎn)生的活性因子，在信息傳遞、激活、免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，能夠介導(dǎo)T細胞、B細胞增殖、分化〔16〕。IL-6在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡中發(fā)揮重要作用〔17,18〕。本研究顯示，20 ng/ml IL-6能夠促進人肝癌HepG2細胞的增殖，但HMA能抑制IL-6對HepG2細胞增殖的促進作用，且隨濃度的增加抑制作用逐漸增強，提示HMA抗人肝癌細胞增殖的活性可能通過抑制IL-6及相關(guān)信號通路來實現(xiàn)。

IL-6/STAT3信號通路與肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，IL-6介導(dǎo)的STAT3活化后能夠明顯上調(diào)惡性腫瘤細胞的增殖、分化，抑制BCL-xl、Survivin、髓細胞白血病(MCL)1等細胞凋亡基因的表達，發(fā)揮抗細胞凋亡的生物學(xué)作用〔19,20〕。BCL-2、Bax、Caspase-9是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與細胞凋亡進程明顯相關(guān)的基因，其中BCL-2發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，Bax、Caspase-9發(fā)揮促進細胞凋亡的作用〔21〕。本研究結(jié)果提示HMA能逆轉(zhuǎn)IL-6對HepG2細胞的影響，促進HepG2細胞凋亡。STAT3蛋白磷酸化為具有活性的p-STAT3后發(fā)揮生物學(xué)作用，本研究中IL-6能促進HepG2細胞STAT3蛋白磷酸化，而加入不同濃度的HMA后STAT3蛋白磷酸化水平明顯下降，提示HMA在HepG2細胞中能夠降低IL-6/STAT3信號通路活性，抑制細胞的增殖和分化。

綜上所述，HMA對人肝癌HepG2細胞具有明顯的體外抑制作用，同時能夠誘導(dǎo)細胞凋亡；抑制IL-6/STAT3信號通路是其作用機制之一，能夠為HMA用于肝癌患者的臨床治療提供理論依據(jù)。