劉明盛 張勇

(1成都市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 瀘州 611130；2西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科)

卵巢癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。卵巢癌的病理類型較多，臨床上以上皮細胞來源的漿液性卵巢癌最為常見〔1〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度大于200 bp，但不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA〔2〕。LncRNA的異常表達與卵巢癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，且其機制多為負向調(diào)控了某種抑癌微小RNA(miRNA)的表達。例如，LncRNA NEAT1在卵巢癌中呈高表達且這部分患者預(yù)后較差〔3〕，分子研究證實LncRNA NEAT1通過下調(diào)miR-194的表達進而促進EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達而促進腫瘤EMT轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移〔4〕；經(jīng)典的促癌性PI3K/AKT通路則可以被LncRNA MALAT1負性調(diào)節(jié)，進而逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞多重耐藥表型〔5〕。LncRNA MIAT是近年來鑒定出的一種新的LncRNA，本研究旨在探索LncRNA MIAT對卵巢癌侵襲的影響，以期對LncRNA MIAT成為卵巢癌分子治療靶標提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1組織標本 本研究選取2014年1月至2015年1月成都市第五人民醫(yī)院50例卵巢癌與對應(yīng)癌旁組織。

1.2細胞來源及主要試劑 SKOV3細胞由我科實驗室保存；LncRNA MIAT siRNA及陰性對照siRNA由美國Santa Cruz公司設(shè)計并合成；miR-150(MQPS0000665-1)及U6(MQP-0201)引物購自廣州銳博生物科技有限公司；IGFBP1引物(上游5′-TCACAGCAGACAGTGTGAGAC-3′；下游5′-CCCAG GGATCCTCTTCCCAT-3′)，GAPDH引物(上游5′-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3′；下游5′-GCGCCCA ATACGACCAAATC-3′)、Trizol試劑(15596-026)、RT-PCR試劑盒、qPCR試劑盒及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(11668-027)均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國康寧公司，兔抗人IGFBP1單克隆抗體(#31025)及兔抗人GAPDH單克隆抗體(#5174)均購自美國CST公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；DMEM液體細胞培養(yǎng)基購自Mediatech公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.3qRT-PCR 標本及細胞RNA由Trizol試劑提取。反轉(zhuǎn)錄PCR條件設(shè)定為：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循環(huán)次數(shù)1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循環(huán)40次；72℃ 10 min。通過2-△△Ct法以GAPDH為內(nèi)參計算LncRNA MIAT及IGFBP1 mRNA的相對表達量；以U6為內(nèi)參計算miR-150的相對表達量。

1.4細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 SKOV3細胞于適宜條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代。將SKOV3細胞按適宜密度接種6孔板。實驗分組：LncRNA MIAT組(si-MIAT)每孔加入100 pmol的LncRNA MIAT siRNA、2 ml完全培養(yǎng)基及5 μl Lipofectamine 2000；陰性對照組(si-control)每孔加入100 pmol的陰性對照siRNA、2 ml完全培養(yǎng)基及5 μl Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染24 h后進行下一步實驗。

1.5Transwell小室 按1∶8比例采用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，按每孔100 μl包被Transwell小室膜的上室面，制作侵襲小室模型；無基質(zhì)膠包被的Transwell小室用于細胞遷移實驗。取對數(shù)生長期的SKOV3細胞以無血清培養(yǎng)基按每孔2萬個接種于上室，下室內(nèi)加入750 μl含10%血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基，甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色。倒置白光顯微鏡下觀察細胞侵襲，計數(shù)遷移或侵襲細胞數(shù)目。

1.7Western印跡 RIPA試劑提取細胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5% 牛血清白蛋白封閉1 h后將條帶孵育于1∶1 000比例稀釋的相應(yīng)一抗中。4℃過夜后，使用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗孵育條帶1 h。ECL曝光條帶。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Kaplan-Meier生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA MIAT在卵巢癌組織中的表達情況 卵巢癌組織中LncRNA MIAT的表達(1.581±0.063)與對應(yīng)癌旁組織(0.438±0.026)差異有統(tǒng)計學意義(t=2.438，P=0.026)。

2.2LncRNA MIAT表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 以卵巢癌組織中LncRNA MIAT在卵巢癌組織中平均表達水平為界值，將50例卵巢癌組織分為LncRNA MIAT高表達組(n=33)及低表達組(n=17)。LncRNA MIAT高表達與卵巢癌患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=6.269，P=0.017)，提示LncRNA MIAT可能與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

表1 LncRNA MIAT表達的臨床病理意義

2.3LncRNA MIAT表達與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 LncRNA MIAT高表達組患者的3年總體生存率(HR=2.392，P=0.004)及無病生存率(HR=1.639，P=0.023)較LncRNA MIAT低表達組更低。LncRNA MIAT高表達是卵巢癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素之一(HR=3.318，P=0.009；HR=2.551，P=0.012)。見圖1和表2。

圖1 LncRNA MIAT異常表達對患者預(yù)后的影響

表2 卵巢癌患者術(shù)后3年生存率相關(guān)因素的COX比例風險回歸分析

2.4LncRNA MIAT對卵巢癌細胞遷移及侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染LncRNA MIAT特異性siRNA的細胞內(nèi)LncRNA MIAT表達水平為(0.257±0.028)，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞內(nèi)LncRNA MIAT表達水平為(0.884±0.035)，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.375，P=0.008)。si-MIAT組遷移細胞數(shù)量〔(95.112±8.254)個〕顯著低于si-control組遷移細胞數(shù)量〔(150.381±9.013)個；t=6.223，P=0.021〕。si-MIAT組侵襲細胞數(shù)量(68.291±6.364)顯著低于si-control組侵襲細胞數(shù)量〔(98.462±7.128)個；t=3.328，P=0.035〕。見圖2。

圖2 LncRNA MIAT對卵巢癌細胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫，×200)

2.5過表達LncRNA MIAT對下游靶點miR-150表達的調(diào)節(jié)作用 si-MIAT組miR-150表達水平(0.632±0.051)顯著高于si-control組(0.231±0.103；t=3.881，P=0.027)。si-MIAT組細胞內(nèi)IGFBP1 mRNA的表達水平(0.231±0.042)顯著低于si-control組(0.528±0.095；t=2.168，P=0.036)。si-MIAT組細胞內(nèi)IGFBP1蛋白的表達水平(0.331±0.026)顯著低于si-control組為(0.582±0.014；t=2.275，P=0.032)。見圖3。

圖3 沉默LncRNA MIAT表達抑制SKVO3細胞內(nèi)IGFBP1蛋白的表達水平

3 討 論

LncRNA MIAT作為一種新發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，其臨床意義尚不完全清楚〔6〕。在缺血性腦卒中患者的血液標本中，LncRNA MIAT的表達水平顯著升高，并與患者的神經(jīng)功能缺損評分呈明顯正相關(guān)，高表達LncRNA MIAT的腦卒中患者死亡率較低表達者顯著升高〔7，8〕。在肝細胞癌〔9〕和胰腺癌〔10〕中，高表達LncRNA MIAT預(yù)示著患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)和較短的總體生存期。本研究表明在LncRNA MIAT在卵巢癌中的異常高表達導致了腫瘤生物學功能發(fā)生的變化，導致腫瘤早期復(fù)發(fā)和患者死亡。從目前的研究證據(jù)來看，在不同類型的惡性腫瘤中的生物學功能并不完全相同。在乳腺癌〔11〕中，高表達LncRNA MIAT能促進乳腺癌細胞增殖并抑制細胞凋亡的發(fā)生；在非小細胞肺癌〔12〕中，LncRNA MIAT不僅能夠促進細胞增殖，同時還有增強細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。LncRNA發(fā)揮生物學功能的機制主要是作為分子海綿吸附某些miRNA〔13〕，microRNA主要通過結(jié)合靶基因3′-UTR區(qū)而發(fā)揮負向調(diào)控作用〔14〕。文獻〔15〕證實IGFBP1在卵巢癌中能發(fā)揮促腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，提示LncRNA MIAT發(fā)揮促癌作用的分子途徑可能是通過下調(diào)miR-150進而促進癌基因IGFBP1的表達來實現(xiàn)的。

綜上，LncRNA MIAT在卵巢癌高表達，lncRNA MIAT促進卵巢癌侵襲的作用可能是通過調(diào)控miR-150/IGFBP1信號通路的活化來實現(xiàn)的。