鄭佳林 郭麗璇 金惠英 吳靜

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610075)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病，研究表明抑制神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)和凋亡是AD的潛在治療靶點(diǎn)〔1,2〕。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在AD患者的外周血中失調(diào)，可作為AD的候選生物標(biāo)志物〔3,4〕。miR-105-5p在帕金森病患者及神經(jīng)疾病患者血漿中異常上調(diào)，可作為帕金森病的潛在生物標(biāo)志物〔5〕。然而，關(guān)于miR-105-5p在AD中的作用及下游機(jī)制未見研究。本研究旨在分析miR-105-5p對AD體外模型細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，并進(jìn)一步識別miR-105-5p的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12購自美國典型物保藏中心；10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Lipofectamin2000、TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒購自中國碧云天公司；miR-105-5p模擬物(miR-105-5p mimic)及陰性對照(NC mimic)、miR-105-5p抑制劑(miR-105-5p inhibitor)及陰性對照(NC inhibitor)、THBS1過表達(dá)質(zhì)粒(pc-THBS1)及陰性對照(pc-NC)均購自上海吉滿生物科技有限公司；Renilla-GloTM螢光素酶檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；anti-THBS1、anti-GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自上海艾博抗公司；MCO-18AC細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自日本Panasonic公司；ABI-7300型熒光定量PCR儀均購自美國ABI公司；ST-360型全自動酶標(biāo)儀購自上?？迫A醫(yī)療設(shè)備有限公司；DYCZ-25D型蛋白電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并添加100 U/ml的青霉素連續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞使用胰蛋白酶消化并離心重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，接種于96孔板中培養(yǎng)至80%匯合。將PC12細(xì)胞分為對照組(正常培養(yǎng)狀態(tài)下的PC12細(xì)胞)、模型組〔25 μmol/L β-淀粉樣蛋白(Aβ25-35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞〕、NC inhibitor組(轉(zhuǎn)染NC inhibitor至模型組細(xì)胞)、miR-105-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p inhibitor至模型組細(xì)胞)、NC mimic組(轉(zhuǎn)染NC mimic至模型組細(xì)胞)、miR-105-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimic至模型組細(xì)胞)、miR-105-5p inhibitor+si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC和miR-105-5p inhibitor至模型組細(xì)胞)、miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p inhibitor和si-THBS1至模型組細(xì)胞)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 收集各組細(xì)胞，在冰上裂解勻漿后Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。檢測純度后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在ABI-7300上進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-105-5p和THBS1mRNA的相對表達(dá)量。各分子引物序列如下：miR-105-5p:正義鏈5′-TCGGCAGGTCAAATGCTCAGACTCC-3′,反義鏈5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；THBS1：正義鏈5′-AGACTCCGCATCGCAAAGG-3′,反義鏈5′-TCACCACGTTGTTGTCAAGGG-3′；GAPDH：正義鏈5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反義鏈5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；U6：正義鏈5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′，反義鏈5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 使用ELISA試劑盒檢測各組轉(zhuǎn)染組中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β水平。將各組細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，收集各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)制造商的說明，依次滴加一抗工作液、酶標(biāo)抗體工作液、底物工作液及反應(yīng)終止液，在450 nm處檢測各組吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組TNF-α及IL-1β水平。

1.5CCK-8實(shí)驗(yàn) 將各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞以5 000個/孔的密度接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在第24 h、48 h和72 h時(shí)，向每孔中滴加10 μl的CCK-8試劑。37℃下孵育1 h后，在酶標(biāo)儀上分別測量各組細(xì)胞吸光度值(OD=450 nm)。

1.6流式細(xì)胞術(shù) 使用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞接種于6孔板后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清液。根據(jù)AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明：使用4℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI，避光環(huán)境下室溫孵育15 min，并在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組PC12細(xì)胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能與miR-105-5p結(jié)合的靶基因，以THBS1為研究對象。使用Lipofectamine2000將THBS1-WT或THBS1-MUT與NC mimic或miR-105-5p mimic共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后分析各組熒光素酶活性。

1.8Western印跡 使用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂牛奶封閉。與適當(dāng)稀釋的一抗(anti-THBS1)和anti-GAPDH在4℃下孵育過夜，次日取出TBST洗膜后與HRP標(biāo)記的二抗工作液在室溫下孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色成像，Image J計(jì)算灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-105-5p和THBS1表達(dá)水平比較 與對照組miR-105-5p的表達(dá)水平(1.011±0.127)相比，模型組(1.731±0.070)顯著上調(diào)(P<0.05)，與對照組THBS1的表達(dá)水平(1.000±0.081)相比，模型組(0.470±0.161)顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.2兩組TNF-α、IL-1β水平比較 與對照組相比，模型組TNF-α和IL-1β水平均顯著升高；與NC inhibitor組相比，miR-105-5p inhibitor組TNF-α和IL-1β水平均顯著下降(均P<0.05)，見表1。

2.3各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞活力比較 與對照組細(xì)胞的凋亡率相比，模型組顯著升高(P<0.05)，與NC inhibitor組細(xì)胞凋亡率相比，miR-105-5p inhibitor組顯著下降(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后，與對照組細(xì)胞活力相比，模型組顯著降低(P<0.05)與NC inhibitor組細(xì)胞活力相比，miR-105-5p inhibitor組顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

表1 各組TNF-α、IL-1β、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力比較

2.4miR-105-5p和THBS1的靶向結(jié)合關(guān)系 通過在線數(shù)據(jù)庫StarBase預(yù)測到miR-105-5p與THBS13′UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)。THBS1-WT+NC mimic組與THBS1-WT+miR-105-5p mimic組的熒光素酶活性分別為1.02±0.11與0.72±0.07，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，THBS1-MUT+NC mimic組與THBS1-MUT+miR-105-5p組熒光素酶活性分別為1.03±0.10與0.91±0.09，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC mimic組THBS1蛋白水平(1.06±0.14)相比，miR-105-5p的過表達(dá)(0.23±0.04)可顯著降低THBS1在AD細(xì)胞模型中的蛋白水平(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-105-5p靶基因的預(yù)測及過表達(dá)miR-326對THBS1蛋白水平的影響

2.5下調(diào)miR-105-5p和THBS1對AD模型細(xì)胞中炎癥因子的影響 miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組TNF-α及IL-1β水平顯著高于miR-105-5p inhibitor+si-NC組(P<0.05)，見表3。

2.6下調(diào)miR-105-5p和THBS1對AD模型細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-105-5p inhibitor+si-NC組相比，miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染48 h后，miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組細(xì)胞活力顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-105-5p inhibitor和si-THBS1對細(xì)胞中炎癥因子水平、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡率的影響

3 討 論

miRNA被證實(shí)可通過調(diào)控AD中相關(guān)生物標(biāo)志物參與AD進(jìn)展〔6〕。有研究表明miR-105-5p可在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用并抑制癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展〔7,8〕。THBS1可與包括細(xì)胞受體、生長因子、細(xì)胞因子及蛋白酶在內(nèi)的多種配體相互作用，從而調(diào)節(jié)各種生理和病理過程〔9,10〕。有研究表明，THBS1可通過維持線粒體動力學(xué)和線粒體功能的平衡，調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞活性，是AD的潛在治療靶點(diǎn)〔11〕。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-105-5p可調(diào)控AD模型細(xì)胞中的炎性介質(zhì)的釋放、細(xì)胞增殖與凋亡。