馮秀梅 ，馬 蘭，羅玉群 ，李海濱，馬紋蕊

(1.青海省中醫(yī)院乳腺科，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,青海 西寧 810008)

現(xiàn)階段，乳腺癌的治療多采用以手術(shù)為主的綜合化療，輔助治療如放化療、內(nèi)分泌治療和生物靶向治療在其中亦扮演著至關(guān)重要的角色[1]。同時(shí)，隨著健康篩查的普及，乳腺癌的發(fā)生率和病死率狀況得到改善[2]。然而，即使在診療水平不斷完善的今天，乳腺癌患者的確診率、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然居高不下[3]。尋找合理而有效的乳腺癌治療策略和藥物一直是醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)問題。中醫(yī)藥治療腫瘤已有悠久歷史，且成效頗為顯著，具有改善患者生存質(zhì)量、降低轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率、延長患者生存期等優(yōu)勢[4-5]，已成為手術(shù)、放化療、基因療法外的重要治療手段。

氣機(jī)不暢則氣郁血瘀。在中醫(yī)學(xué)上，乳腺癌的發(fā)生與氣血失調(diào)、瘀血痰飲密切相關(guān)[6]。此外，microRNA表達(dá)譜的變化已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。同時(shí)，既往研究已證實(shí)microRNA-100(miR-100)可直接負(fù)向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖能力[8]。鑒于此，本研究探究益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞系增殖侵襲能力及miR-100表達(dá)水平的影響，以期為乳腺癌篩查提供良好生物學(xué)標(biāo)志物，并為該腫瘤的中醫(yī)治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 MCF-7乳腺癌細(xì)胞系(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)以含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于36 ℃的飽和濕度恒溫孵育箱中培養(yǎng)。取生長良好的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)試劑、儀器及藥物 RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司，USA)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，USA)；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清(FBS；Gibco公司，USA)；磷酸鹽緩沖液(PBS；Hyclone公司，USA)；Tap Man MicroRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(Applied Biosystems公司，USA)；二甲基亞砜(DMSO；國藥集團(tuán)，中國)；噻唑藍(lán)(MTT；Sigma公司，USA)；培養(yǎng)板及離心管(Corning公司，USA)；高速恒溫離心機(jī)(Thermo Forma公司，USA)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek公司，USA)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)。益氣活血方配方由本院制劑部提供，該藥方組成包括黃芪、薏仁、茯苓、白術(shù)、紅花、當(dāng)歸等；以上藥物以煎煮方式濃縮至1.4 g/ml，制備后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理：取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，采用含10% FBS培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。將上述制備藥物采用培養(yǎng)液稀釋為20、40和80 mg/L，設(shè)置高、中和低濃度分別培養(yǎng)細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組(無藥物的相同培養(yǎng)液)。

1.3.2 qRT-PCR檢測miR-100的表達(dá)水平：取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，依據(jù)上述方法分組處理細(xì)胞。吸取細(xì)胞培養(yǎng)基，以1.0 ml TRizol吹打細(xì)胞，室溫裂解2～3 min。離心棄上清，計(jì)算RNA濃度和波長260 nm和280 nm處吸光度值。按照Tap Man Micro RNA熒光定量PCR檢測試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用qRT-PCR進(jìn)行定量檢測；以U6為內(nèi)參。以相對(duì)定量法進(jìn)行分析，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由Applied Biosystems公司合成。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算CT值，應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算miR-100相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 MTT法檢測乳腺癌細(xì)胞增殖情況：應(yīng)用MTT法檢測乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞增殖情況并對(duì)比組間差異。依據(jù)商法將益氣活血方濃縮液用DMSO溶液溶解并稀釋，取對(duì)數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔板，以20、40和80 mg/L濃度的益氣活血配方溶液培養(yǎng)細(xì)胞。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔避光加入20 μl 0.5%MTT溶液，孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液(150 μl)。于波長490 nm處采用酶聯(lián)免疫吸附儀檢測各孔吸光度值(OD)。以不含藥方溶液的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照。采用MTT法檢測MCF-7細(xì)胞增殖抑制率。MCF-7細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.4 Transwell小室法檢測乳腺癌細(xì)胞侵襲情況：應(yīng)用Transwell小室法檢測乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞增殖情況并對(duì)比組間差異。同法處理細(xì)胞，以20、40、80 mg/L濃度的益氣活血配方溶液培養(yǎng)細(xì)胞為高、中和低濃度實(shí)驗(yàn)組，以不含藥物的相同培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組。取Transwell小室加入Matrigel膠，接種細(xì)胞前加入50 μl含體積分?jǐn)?shù)1%FBS的培養(yǎng)液，37 ℃下培養(yǎng)30 min，再次應(yīng)用含1%FBS的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種于上室；下室加入600 μl DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS清洗上室后拭去未侵襲細(xì)胞。細(xì)胞侵襲抑制率計(jì)算公式如下所示：MCF-7細(xì)胞侵襲抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù))×100%。

1.3.5 Western blot法檢測增殖侵襲相關(guān)蛋白：取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，依據(jù)上述方法分組處理細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清。采用BCA法檢測蛋白質(zhì)含量。取蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜應(yīng)用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后，將PVDF膜與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白特異性周期蛋白D1(Cyclin D1)和侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)一抗孵育過夜(4 ℃)；TBST洗滌3次后，常溫下與HRP標(biāo)記二抗孵育1 h。ECL法顯影后采用凝膠成像儀掃描膠片并保存和分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間樣本數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間樣本數(shù)據(jù)比采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞miR-100表達(dá)水平的影響 PCR檢測對(duì)照組miR-100表達(dá)水平為(1.00±0.05)；實(shí)驗(yàn)組miR-100表達(dá)水平升高，其中低、中和高濃度組分別為(1.38±0.05)、(1.54±0.05)和(1.71±0.07)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，與較低濃度組相比，較高濃度組miR-100表達(dá)水平亦呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組間差異亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，提示miR-100表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組間升高趨勢呈劑量依賴性(圖1)。

圖1 PCR實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞miR-100表達(dá)水平的影響

2.2 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響 見表1。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)檢測，組間比較結(jié)果顯示：在培養(yǎng)24 h時(shí)，各組間細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示細(xì)胞增殖能力下降；同時(shí)，與較低濃度組相比，較高濃度組細(xì)胞增殖抑制率亦呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示細(xì)胞增殖能力在實(shí)驗(yàn)組受抑制，且呈劑量依賴性。

表1 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.3 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲的影響 見表2。依據(jù)Transwell小室法檢測結(jié)果，益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲具有抑制作用，具體表現(xiàn)為與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲抑制率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P< 0.05)，提示細(xì)胞侵襲能力的下降；同時(shí)，與較低濃度組相比，較高濃度組細(xì)胞侵襲抑制率亦呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組間比較亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，提示細(xì)胞侵襲能力在實(shí)驗(yàn)組受抑制，且呈劑量依賴性。

表2 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲抑制率的影響

2.4 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)水平的影響 見表3。不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)水平Western blot蛋白檢測結(jié)果提示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，與較低濃度組相比，較高濃度組Cyclin D1和MMP-9蛋白表達(dá)水平亦呈下降趨勢，實(shí)驗(yàn)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示Cyclin D1和MMP-9蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組間降低趨勢呈劑量依賴性。

表3 不同濃度益氣活血方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)水平的影響

3 討 論

眾所周知，細(xì)胞增殖侵襲等是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的基本特征，亦是患者病情轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因[9]。近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升[10-11]，位居女性腫瘤發(fā)病率首位，其病死率不容樂觀?，F(xiàn)階段的乳腺癌綜合治療手段眾多，如手術(shù)、以順鉑為主的化療、放療等。然而，上述療法亦不同程度存在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、藥物耐藥性、不良反應(yīng)等?；诖?，以中醫(yī)藥為輔的治療方案一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。其在減輕化療藥物不良反應(yīng)、增強(qiáng)抑癌效果、提高患者耐受性和生存質(zhì)量等方面作用顯著[12-13]。

在中醫(yī)學(xué)中，“虛瘀致癌”理論已逐漸獲得認(rèn)同[14]。正氣不足、氣血運(yùn)行受擾，導(dǎo)致瘀血形成；同時(shí)，受外邪侵襲，轉(zhuǎn)移微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更高[15]。乳腺癌在中醫(yī)學(xué)中與“乳巖”“乳癰”“乳痛”和“乳痃”等相對(duì)應(yīng)。古書有記載：“內(nèi)寒之氣，經(jīng)虛血結(jié)”“憂怒郁悶，昕夕積累，脾氣消阻，肝氣橫逆，遂成隱核”“乳巖初結(jié)核隱疼，肝脾兩損氣郁凝”[16-17]。乳腺癌的病機(jī)與肝、腎、脾、胃等器官均存在關(guān)聯(lián)。肝氣不舒、肝脾不和、氣滯血瘀、郁結(jié)傷脾、瘀毒蘊(yùn)結(jié)，經(jīng)絡(luò)受阻，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[18]。因此，“益氣活血法”不失為一種治療乳腺癌的良方。

本研究選用益氣活血方由黃芪、薏仁、茯苓、白術(shù)、紅花、當(dāng)歸等組成。重用補(bǔ)氣血的黃芪、薏仁、茯苓、白術(shù)、當(dāng)歸；活血化瘀的紅花和當(dāng)歸；另外，茯苓、白術(shù)亦可健脾益氣，黃芪、白術(shù)可補(bǔ)氣健脾固表，最終發(fā)揮益氣扶正、補(bǔ)氣健脾、生津補(bǔ)氣、除痰祛濕等功效，進(jìn)而益氣、除濕、和中、補(bǔ)血、健脾[19-20]。本研究取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，設(shè)置益氣活血方高、中和低濃度實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置對(duì)照組。結(jié)果顯示，與無藥物處理對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-100表達(dá)水平升高、細(xì)胞增殖抑制率提升、細(xì)胞侵襲抑制率升高，且Cyclin D1和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)與較低濃度組相比，較高濃度組miR-100表達(dá)水平升高、細(xì)胞增殖抑制率和侵襲抑制率升高，以及且Cyclin D1和MMP-9蛋白表達(dá)水平下降趨勢呈劑量依賴性。上述結(jié)果提示，益氣活血方可有助于提高具有抑癌作用的miR-100表達(dá)水平，并降低細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)水平，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，本研究提示益氣活血方可提高miR-100表達(dá)水平、降低Cyclin D1和MMP-9表達(dá)水平、進(jìn)而發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲的功能。本研究提示該組方可有效調(diào)節(jié)腫瘤增殖侵襲過程，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，為益氣活血方治療乳腺癌提供了思路。