郭 璐，趙兵剛，馮 婷，劉 沛

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院急診科，陜西 西安 710032)

壓瘡又稱褥瘡、壓力性潰瘍，其發(fā)生主要是在壓力、摩擦力以及剪切力等物理力學(xué)復(fù)合作用下所引起的皮膚及皮下組織的局限性損傷，往往由于其久治不愈，最終合并嚴(yán)重感染導(dǎo)致惡病質(zhì)、營養(yǎng)不良、終末期患者的死亡。組織壞死是Ⅲ期及以上壓瘡重要的病理學(xué)改變之一，程序性壞死是一種由死亡受體和配基啟動(dòng)、依賴于受體相互作用蛋白活化介導(dǎo)的可調(diào)控性細(xì)胞壞死，其中受體相互作用蛋白激酶(Receptor-interacting protein，RIP)1/3是程序性壞死關(guān)鍵控制信號(hào)分子[1-2]，聯(lián)同下游的混合系激酶區(qū)域樣蛋白(Mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)，共同決定細(xì)胞命運(yùn)-凋亡、壞死或存活。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，生肌散具有祛風(fēng)去瘀，解毒生肌之功效，可用于瘡癤久潰，肌肉不生，久不收口[3-4]。然而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)生肌散的作用機(jī)制研究甚少。本研究通過制作SD大鼠Ⅲ期壓瘡模型，給予生肌散創(chuàng)面處理，對(duì)比各組大鼠壓瘡組織病理學(xué)、RIP1/RIP3/MLKL蛋白表達(dá)特征以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)以及炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量變化，以期為生肌散治療壓瘡提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF雄性SD大鼠60只，體重(250±30)g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SCXK(陜) 2019-001]，大鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物室內(nèi)，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，溫度恒溫在25 ℃，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理要求并給予人道關(guān)懷(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)為：IACUC-200403)；生肌散購自北京同仁堂制藥廠，國藥準(zhǔn)字 Z11020782。大鼠IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為70-EK101B2，70-EK1822)；MDA檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)分別為S13245，P0010S，C0105)；山羊抗兔IgG二抗、兔抗大鼠RIP1、RIP3、MLKL抗體(購自美國Abcam公司，批號(hào)分別為ab34712，ab51475，ab47633)。

1.2 儀器與器械 儀器：聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司；酶標(biāo)儀購自美國Biotekiotek公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司；恒溫箱(陜西西安環(huán)科實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。器械：經(jīng)嚴(yán)格測量磁性磁鐵(直徑10 mm、厚2 mm、質(zhì)量2.0 g、1600 Gs)、經(jīng)高溫高壓滅菌的鐵片(直徑10 mm、厚1 mm、質(zhì)量1.0 g)、無菌器械、電子稱。

1.3 動(dòng)物模型的建立與分組 建立Ⅲ期大鼠壓瘡模型[6]，具體方法如下：使用異氟烷氣體麻醉大鼠，脫毛處理暴露實(shí)驗(yàn)鼠左臀部周圍皮膚，備皮區(qū)域至少5 cm×5 cm大小，碘伏充分消毒手術(shù)區(qū)。在大鼠左側(cè)臀部做一深至肌肉層切口，鈍性分離肌層，埋入圓形鐵片(直徑10 mm，厚1 mm，質(zhì)量1.0 g)，連續(xù)縫合切口，蘇醒后正常喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，在皮膚外，放置相同大小圓形磁鐵(直徑10 mm、厚2 mm、質(zhì)量2.0 g、1600 Gs)，利用磁性對(duì)局部皮膚及肌肉產(chǎn)生壓力，造成局部組織缺血，每次缺血時(shí)間為2 h，間隔30 min，此為1個(gè)循環(huán)操作，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)操作(加壓缺血2 h，間隔30 min，再進(jìn)行加壓)。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：鐵片邊緣紅腫、糜爛，傷口滲液或滲血，受壓處皮膚變黑變硬，針刺皮膚未見出血，無痛覺，無筋膜、肌肉、骨骼等暴露。

按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組各20只。模型組：制作Ⅲ期大鼠壓瘡模型，成模后，每日清創(chuàng)處理創(chuàng)面，創(chuàng)面外敷0.9%氯化鈉溶液紗布，2次/d，共7 d；對(duì)照組：僅同部位埋入磁鐵不予磁性加壓，其余處理同模型組；治療組：成模后，創(chuàng)面外敷生肌散2 mg，厚度為1 mm，然后用紗布覆蓋，2次/d，共7 d，其余處理同模型組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脊椎脫臼法處死大鼠取材，各組大鼠壓瘡皮膚組織提取總蛋白后置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，冰上迅速切取受壓中心部位肌肉組織，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯溶液浸泡透明，浸蠟包埋，使用切片機(jī)切成5 μm厚薄片，置入60 ℃烤箱中烘烤后脫蠟，進(jìn)行蘇木素染色、伊紅染色，水洗后脫水，二甲苯溶液浸泡透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 蛋白免疫印跡法比較各組大鼠壓瘡皮膚組織RIP1、RIP3、MLKL的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，提取組織蛋白，經(jīng)用100 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后，分別加兔抗大鼠RIP1(1∶1000)、RIP3(1∶1000)、MLKL(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2500)孵育2 h，洗膜后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析，并以β-actin為內(nèi)參。

1.6 試劑盒法測定各組大鼠壓瘡皮膚組織MDA含量 按照說明書，將MDA檢測工作液加入酶標(biāo)板各孔，接著加入待測定樣本，以70 ℃高溫加熱，并整體震動(dòng)待混合液徹底溶解。酶標(biāo)儀(532 nm波長)進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，利用工作曲線計(jì)算樣本蛋白的濃度，MDA含量用nmol/mg蛋白表示。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法測量IL-1β和TNF-α含量 取各組組織提取蛋白0.1 ml，同時(shí)加入陽性和陰性的對(duì)照標(biāo)本，按照說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品和檢測溶液，并按照操作步驟操作，加入終止液后使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度A。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間與組內(nèi)比較均采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠壓瘡組織病變比較 60只大鼠在觀察期間耐受良好，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。肉眼觀察結(jié)果：模型組大鼠壓瘡皮膚可見鐵片邊緣壓紅，有明顯水腫帶，可有表皮的糜爛，局部有滲液或滲血，受壓部分皮膚顏色加深、變硬，針刺皮膚未見出血，無疼痛反應(yīng)，未見筋膜、肌肉、骨骼等暴露。治療組創(chuàng)面病變較模型組明顯好轉(zhuǎn)。對(duì)照組大鼠皮膚組織未見明顯異常(圖1)。

光鏡觀察結(jié)果：模型組大鼠壓瘡皮膚組織表面鱗狀上皮細(xì)胞損傷、缺失，真皮層菲薄，有大量淋巴細(xì)胞和中心粒細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫明顯，病灶深達(dá)肌肉層，肌纖維萎縮。治療組大鼠壓瘡皮膚組織病變較模型組好轉(zhuǎn)，表皮和真皮層損傷斷裂、壞死范圍明顯減少，僅可見少量中性粒細(xì)胞浸潤。對(duì)照組大鼠皮膚組織未見明顯異常(圖1)。

圖1 各組大鼠壓瘡皮膚組織病變觀察結(jié)果(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠壓瘡組織中RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與模型組比較，治療組RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

表1 各組大鼠壓瘡組織中RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)比較

圖2 各組大鼠壓瘡組織中RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)比較

2.3 各組大鼠壓瘡組織MDA含量比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組MDA含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠壓瘡組織MDA含量比較(nmol/mg)

2.4 各組大鼠壓瘡組織中IL-1β和TNF-α含量比較 見表3。與對(duì)照組比較，模型組IL-1β和TNF-α含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與模型組比較，治療組IL-1β和TNF-α含量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠壓瘡組織中IL-1β和TNF-α含量比較(pg/mg)

3 討 論

由于Ⅲ期壓瘡屬于開放創(chuàng)面，常常引起嚴(yán)重感染，導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合，極大影響患者預(yù)后。各大醫(yī)院均成立專門針對(duì)壓瘡防治的多學(xué)科協(xié)作小組，旨在提高壓瘡的預(yù)防，加速創(chuàng)面愈合，尤其針對(duì)Ⅲ期壓瘡的防治，縮短患者平均住院日，減少醫(yī)療費(fèi)用，是臨床中的重要任務(wù)[5]。

目前制作動(dòng)物壓瘡模型裝置主要分為非侵入性裝置與侵入性裝置兩大類[6]。非侵入性裝置主要有以下兩種：體外無創(chuàng)壓力裝置，但使用該裝置時(shí)需要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)處于麻醉狀態(tài)，而使用麻醉藥物導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身肌肉松弛，會(huì)導(dǎo)致最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏移；另外一種是非侵入性磁力加壓裝置，利用兩個(gè)互相吸引的圓形磁鐵之間夾著受試部位，磁力加壓形成皮膚損害，然而這種造模方法并不能制備深部組織損傷的壓瘡模型，因此不適用于Ⅲ期及以上壓瘡的基礎(chǔ)研究。侵入性方法主要有脊髓手術(shù)法與侵入性磁力壓迫法，其中脊髓手術(shù)操作復(fù)雜，造模周期較長，動(dòng)物長期的營養(yǎng)狀態(tài)對(duì)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，并不適合本研究使用。侵入性磁力加壓法是將無菌圓形鐵片置入皮下，同時(shí)外面放置磁鐵，然后反復(fù)施加和去除磁鐵，引起皮膚組織的損傷。該方法造模穩(wěn)定，可控制壓瘡分期。造模以后，實(shí)驗(yàn)大鼠在觀察期間耐受良好，各組均未出現(xiàn)死亡，與其他研究者所得結(jié)果類似[7]。

美國國家壓瘡指導(dǎo)專家組關(guān)于Ⅲ期壓瘡的定義具體如下：全層皮膚損傷，皮下脂肪組織暴露，但未見骨骼肌腱或肌肉，可能存在壞死組織的潛行[8]。但目前研究認(rèn)為，程序性壞死是一種由腫瘤壞死因子受體(Pattern recognition receptor，PRR)等死亡受體和配基啟動(dòng)、依賴于受體相互作用蛋白活化介導(dǎo)的可調(diào)控性細(xì)胞壞死[9-11]。有別于細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，程序性壞死通常發(fā)生于組織細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重障礙的情況下，此時(shí)ATP合成生成嚴(yán)重不足，難以維持凋亡通路關(guān)鍵信號(hào)分子Caspase活性，凋亡通路因而被抑制，細(xì)胞壞死通路被激活[12-14]。RIP1和RIP3均為程序性壞死通路中的關(guān)鍵啟動(dòng)信號(hào)分子，聯(lián)同下游的MLKL，共同決定生命細(xì)胞凋亡、壞死或存活[15]。本實(shí)驗(yàn)里我們通過制作Ⅲ期SD大鼠壓瘡模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠壓瘡組織RIP1、RIP3、MLKL通路關(guān)鍵信號(hào)分子蛋白表達(dá)明顯升高，提示RIP1/RIP3/MLKL 通路介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死在大鼠壓瘡形成中可能起重要的作用。

壓瘡在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中屬“瘡瘍”范疇，由于人體氣血兩虛，若長期臥床，下垂部位局部受壓，加重局部的氣血瘀滯，局部組織缺乏氣血的滋養(yǎng)，出現(xiàn)皮膚潰瘍，因此祛腐生肌、祛瘀補(bǔ)虛是治療壓瘡的重要原則[4]。生肌散具有祛風(fēng)去瘀，解毒生肌之功效，可用于瘡癤久潰，肌肉不生，久不收口，在各種瘡瘍的治療上均有明顯療效。研究結(jié)果顯示，治療組創(chuàng)面病變較模型組明顯好轉(zhuǎn)，且與模型組比較，RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示生肌散可能通過抑制RIP1/RIP3/MLKL 通路介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死，促進(jìn)大鼠壓瘡創(chuàng)面的愈合。

RIP1與TNF-α受體結(jié)合被直接激活，可根據(jù)細(xì)胞能量狀況，選擇激發(fā)細(xì)胞凋亡通路或激活細(xì)胞壞死通路，在組織細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重障礙的情況下，細(xì)胞凋亡通路受到抑制,通過 RIP1/RIP3/MLKL 通道激活程序性壞死[16]。研究者發(fā)現(xiàn)，壓瘡模型大鼠血清TNF-α濃度明顯升高。受損傷的肌肉細(xì)胞可釋放多種炎癥介質(zhì)，主要以IL-1β和TNF-α為主，這些炎癥介質(zhì)可引起細(xì)胞間黏附因子-1等黏附分子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集、附壁、游走等過程，并釋放相應(yīng)的趨化因子，引起一系列炎癥反應(yīng)，從而加重組織水腫的發(fā)生[17-18]。局部IL-1β積聚，可刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，其氧化應(yīng)激效應(yīng)可對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)雙層生物膜產(chǎn)生損傷[17]。脂質(zhì)過氧化過程中可產(chǎn)生MDA，檢測組織中MDA含量是評(píng)估細(xì)胞生物膜脂質(zhì)過氧化損傷的重要手段[19-20]。我們的研究顯示模型組大鼠壓瘡組織中MDA含量、IL-1β和TNF-α含量均明顯增高，且與模型組比較，治療組MDA含量、IL-1β和TNF-α含量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此我們推斷，大鼠壓瘡發(fā)生發(fā)展過程中，組織細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生IL-1β和TNF-α等炎癥因子，引起的一系列應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的生物膜脂質(zhì)過氧化可能與細(xì)胞程序性壞死密切相關(guān)，但經(jīng)生肌散處理大鼠壓瘡創(chuàng)面后，可減少組織細(xì)胞中IL-1β和TNF-α產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過氧化，減少組織損傷，然而具體損傷機(jī)制仍有待后續(xù)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，本研究組通過制作SD大鼠Ⅲ期壓瘡模型，生肌散處理創(chuàng)面，比較各組大鼠壓瘡皮膚組織病理學(xué)改變、RIP1/RIP3/MLKL通路關(guān)鍵信號(hào)分子蛋白表達(dá)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛、IL-1β和TNF-α含量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIP1/RIP3/MLKL通路在壓瘡形成中發(fā)揮重要作用，生肌散可抑制RIP1/RIP3/MLKL 通路介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死，減少組織中IL-1β和TNF-α產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過氧化，減少組織損傷，促進(jìn)大鼠壓瘡創(chuàng)面的愈合。