周 雪

(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院,遼寧 沈陽 110000)

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 研究對象：Lewis大鼠55只，SPF級，均為雄性，周齡為8周，體重200～220 g，平均(213.24±4.66) g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心提供[許可證號：SCXK(粵)2018-0002]。飼養(yǎng)在動物房中，溫度21～23 ℃，相對濕度50%～60%，定時通風(fēng)換氣保持空氣潔凈，噪音<50 dB，大鼠于籠內(nèi)自由活動進(jìn)食，飼以全價營養(yǎng)顆粒飼料和無菌過濾水，定期打掃鼠籠并消毒。飼養(yǎng)5 d使其適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 主要藥品與試劑：純化豬心肌肌球蛋白，美國Sigma公司產(chǎn)品，采用0.3 mol/L氯化鉀溶液溶解并配制為濃度10 mg/ml的豬心肌肌球蛋白溶液，-80 ℃保存?zhèn)溆?；完全弗氏佐劑，美國Sigma公司產(chǎn)品；滅活結(jié)核桿菌H37Ra，購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。三七總皂苷，CAS號：88105-29-7，純度：UV≥95%，貨號：YDS0054，規(guī)格：每瓶10 mg，購自無錫云萃生物科技有限公司，用蒸餾水溶解制成三七總皂苷溶液，濃度分別調(diào)整成10、20 mg/ml；甲氨蝶呤片，規(guī)格：每片2.5 mg，國藥準(zhǔn)字H31020644，批號：20190112，上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，使用時采用蒸餾水溶解配制成濃度為0.1 mg/ml的甲氨蝶呤混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(一步法)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamino-2-phenylindole，DAPI)染色液，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)、TBST緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自福州飛凈生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯色試劑盒，購自北京伊塔生物科技有限公司；兔抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體、山羊抗兔二抗、ECL發(fā)光試劑盒，購自翌圣生物科技(上海)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics，Vevo2100型)；離心機(jī)[德國Hettich，Universal 320(R)型]；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon，Eclipse Ci型)；倒置式熒光顯微鏡(日本Nikon，Ti-E型)；電泳儀(美國Bio-rad，Power Pac 3000型)；全自動圖像工作站(美國Kodak，IS4000R型)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 造模及實(shí)驗方法[6]：大鼠分成對照組(n=11)和造模組(n=44)。將10 mg/ml的豬心肌肌球蛋白溶液與完全弗氏佐劑(含滅活結(jié)核桿菌H37Ra 10 mg/ml)等體積混勻，在4 ℃條件下反復(fù)進(jìn)行抽推，制成油包水狀態(tài)黏稠乳濁液，且經(jīng)鑒定乳化完全。分別于第1天、第8天，造模組大鼠給予豬心肌肌球蛋白乳濁液0.2 ml后足墊皮下注射，對照組給予完全弗氏佐劑0.2 ml后足墊皮下注射；繼續(xù)喂養(yǎng)3 周，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能以明確是否成功建立實(shí)驗性自身免疫性心肌炎模型。

模型建立成功的大鼠被分成模型組、三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組各11只。模型組、對照組分別灌胃給予蒸餾水10 ml/kg，每日1次；三七總皂苷低、高劑量組分別灌胃給予10、20 mg/ml三七總皂苷溶液10 ml/kg，每日1次；甲氨蝶呤組灌胃給予0.1 mg/ml甲氨蝶呤混懸液10 ml/kg，每周1次。各組大鼠均連續(xù)給藥4周。

（1）信息的溝通應(yīng)該涵蓋各個單位的各個層次人員的交流。比如設(shè)計工程師、建設(shè)單位專業(yè)人員以及施工單位、監(jiān)理人員與專業(yè)監(jiān)理工程師的交流與溝通。信息溝通的工作可以以監(jiān)理會議紀(jì)要、監(jiān)理月報等形式進(jìn)行。對項目的全過程進(jìn)行監(jiān)理控制，是為了使全過程成為一個有機(jī)的整體。依據(jù)施工中的不同環(huán)節(jié)的工作內(nèi)容和特點(diǎn)制定不同的管理手段和措施，使各個工作能夠環(huán)環(huán)相扣，這是監(jiān)理工程師在對項目的全過程進(jìn)行監(jiān)理的重要方式。

1.2.2 超聲心動圖測定大鼠心功能[6]：末次給藥12 h后，采用異氟烷吸入麻醉大鼠，仰臥位固定于檢查臺，胸前區(qū)常規(guī)備皮，用小動物超聲影像系統(tǒng)行超聲心動圖檢查，測定左室舒張末內(nèi)徑(Left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter，LVIDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(Left ventricular short axis shortening rate，LVFS)。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理：超聲心動圖結(jié)束后，采用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，然后打開胸腔，將心臟完整取出，分離心尖組織，用10%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋之后，用全自動切片機(jī)連續(xù)切制2 μm切片，貼于防脫載玻片上(經(jīng)3-氨基丙基三乙氧基硅烷處理)，37 ℃干燥16 h后室溫保存，以備HE染色、TUNEL染色、免疫組化染色觀察；其他心肌組織用液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，以用于Western blot法檢測。

1.2.4 HE染色法觀察心肌組織病理學(xué)變化[7]：取心肌組織切片，常規(guī)脫蠟水化，按照HE染色試劑盒說明書操作，依次采用蘇木素染色5 min、自來水洗片1 min、1%鹽酸酒精分化20 s、自來水洗片10 min、自來水返藍(lán)30 min、自來水洗片10 min、1%伊紅染色3 min、自來水洗片30 s，之后將切片分別浸入70%、80%、90%、95%酒精5 min以脫水、浸于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液內(nèi)分別5 min以透明，晾干，中性樹脂封片。

于200倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)采集5個不重復(fù)視野，根據(jù)炎癥浸潤程度對心肌組織進(jìn)行病理學(xué)評分。標(biāo)準(zhǔn)為，0分：無炎癥細(xì)胞浸潤；1分：炎癥細(xì)胞浸潤面積不足5%；2分：5%≤炎癥細(xì)胞浸潤面積<10%；3分：10%≤炎癥細(xì)胞浸潤面積<20%；4分：炎癥細(xì)胞浸潤面積≥20%；各視野評分平均值即為該切片心肌組織病理學(xué)評分。

1.2.5 TUNEL染色法觀察心肌組織細(xì)胞凋亡情況[8]：取心肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，PBS洗5 min×3次，然后滴加蛋白酶K工作液100 μl，37 ℃反應(yīng)20 min，PBS洗5 min×3次，滴加DNA酶反應(yīng)液100 μl，37 ℃反應(yīng)30 min，按照TUNEL染色試劑盒說明書配制末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移(TdT)酶反應(yīng)液，并取50 μl低于切片上，37 ℃濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min，PBS洗5 min×3次，滴加異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素工作液50 μl，37 ℃濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min，PBS洗5 min×3次，之后滴加DAPI染色液，室溫避光染色5 min，洗去染液后甘油封片。

在熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡細(xì)胞核被染成綠色，正常細(xì)胞核被染成藍(lán)色。每張切片隨機(jī)采集5個未重疊視野，統(tǒng)計凋亡細(xì)胞以及總細(xì)胞數(shù)量，計算凋亡細(xì)胞率，各視野平均值即為該切片凋亡細(xì)胞率。

1.2.6 免疫組化染色法觀測心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平[8]：取心肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，PBS洗5 min×3次，然后置于0.3%過氧化氫中10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，無菌蒸餾水洗3次，置于PBS內(nèi)微波爐加熱煮沸以修復(fù)抗原，滴加5%牛血清白蛋白，37 ℃反應(yīng)30 min，之后參照試劑盒說明書滴加Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗，4 ℃反應(yīng)18 h，PBS洗10 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃反應(yīng)30 min，PBS洗10 min×3次之后，用DAB試劑盒顯色及蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片。

于400倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)采集5個未重疊視野，通過Image-pro plus 6.0軟件分析各視野細(xì)胞陽性率，計算平均值。

1.2.7 Western blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平[8]：將-80 ℃保存的心肌組織剪碎，與RIPA裂解液混合，冰上靜置10 min，充分研磨后采用超聲破碎儀破細(xì)胞壁，4 ℃，14000 r/min×10 min離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；然后配制SDS-PAGE分離膠和積層膠，放入電泳槽內(nèi)；取適量蛋白質(zhì)樣品與5×上樣緩沖液4∶1混勻，于沸水中處理20 min使蛋白變性；上樣，電泳(恒壓80 V 25 min，恒壓120 V 90 min)至溴酚藍(lán)跑到分離膠下緣；將目的蛋白轉(zhuǎn)至硝基纖維素(NC)膜上，5%脫脂牛奶搖床封閉1 h，NC膜放入1∶1000稀釋的Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin一抗中，4 ℃反應(yīng)16 h后，TBST洗10 min×3次；NC膜置于羊抗兔二抗工作液(1∶2000稀釋)內(nèi)，37 ℃反應(yīng)1 h后，TBST洗10 min×3次；最后采用ECL發(fā)光試劑盒顯影。

采用全自動圖像工作站采集圖像，對分離獲得的蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，計算Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對內(nèi)參β-actin的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間的比較用單因素方差分析，組間多重比較分析用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見表1。模型組LVEF、LVFS水平明顯低于對照組，LVIDd、LVIDs水平顯著高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠LVEF、LVFS水平較高，LVIDd、LVIDs水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

表1 各組大鼠LVIDd、LVIDs、LVEF及LVFS水平比較

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，對照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)整，極少見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列松散，有大量炎性細(xì)胞浸潤間質(zhì)、肌束間，存在小血管擴(kuò)張充血，少量心肌細(xì)胞脂肪變性；三七總皂苷低、高劑量組及甲氨蝶呤組心肌細(xì)胞排列緊密，炎癥細(xì)胞浸潤情況較模型組不同程度改善，偶見小血管擴(kuò)張充血，其中三七總皂苷高劑量組及甲氨蝶呤組改善最明顯(圖1)。

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)評分比較 見表2。模型組的心肌組織病理學(xué)評分高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織病理學(xué)評分較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

表2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)評分比較(分)

2.4 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率比較 見表3(圖2)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

表3 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)免疫組化檢測水平比較 見表4(圖3～5)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，模型組心肌組織Bcl-2表達(dá)水平低于對照組，Bax、Caspase-3表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織Bcl-2表達(dá)水平較高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖2 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

表4 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)免疫組化檢測水平比較(%)

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖3 各組大鼠心肌組織Bcl-2表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖4 各組大鼠心肌組織Bax表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖5 各組大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

2.6 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)Western blot檢測水平比較 見表5(圖6)。模型組心肌組織Bcl-2表達(dá)低于對照組，Bax、Caspase-3表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織Bcl-2表達(dá)水平較高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

表5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平Western blot檢測比較

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組；D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖6 Western blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)結(jié)果

3 討 論

心肌炎最常見的類型為病毒性心肌炎，該病發(fā)生的第一階段為早期病毒直接刺激心肌細(xì)胞導(dǎo)致心肌損傷和功能障礙，第二階段則是自身免疫階段，病毒持續(xù)感染過度激活機(jī)體抗原-抗體反應(yīng)，肌球蛋白等自身抗原促進(jìn)B細(xì)胞釋放抗心磷脂抗體、抗肌球蛋白等自身抗體，使心肌細(xì)胞發(fā)生免疫損傷，進(jìn)一步發(fā)展為以進(jìn)行性心衰為特征的DCM，即第三階段，影響預(yù)后[9]?？梢?，自身免疫反應(yīng)是誘發(fā)DCM的重要機(jī)制[10]。有研究稱，在自身免疫反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷及轉(zhuǎn)變?yōu)橐赃M(jìn)行性心衰為特征的DCM過程中，凋亡起著十分重要的作用[11]。所以，抗細(xì)胞凋亡有可能成為減輕免疫性心肌炎損傷，抑制心肌炎發(fā)展為DCM的作用靶點(diǎn)之一。中醫(yī)認(rèn)為，該病屬于“風(fēng)溫”“心悸”“心癉”“胸痹”等疾病范疇，多因素體虛弱，心氣不足，溫邪侵襲傷及于心所致，心主血脈，外邪侵襲可使血性不暢，阻于脈內(nèi)，形成血瘀，需用活血化瘀之法通利血脈，恢復(fù)血行。三七味甘、微苦，性溫，歸心、肝、脾經(jīng)，有化瘀止血，活血定痛之效，為常用的活血化瘀中藥，也是治療病毒性心肌炎常用的有效單味中藥之一。三七總皂苷是三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和Rg1等成分的總稱，可以發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、延緩纖維化、抑制心肌缺血、抗氧化應(yīng)激等多方面功效[12-13]，在心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)中的應(yīng)用較多。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，三七總皂甙可能通過抑制膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)，來對病毒性心肌炎小鼠發(fā)揮治療作用；有學(xué)者[15]進(jìn)行的體外研究則認(rèn)為，三七總皂苷通過調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)來抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，起到心肌損傷保護(hù)作用。這些研究的結(jié)果為本次研究三七總皂苷對EAM大鼠Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路的影響提供了一定的理論支持。

EAM動物模型是研究自身免疫性心肌炎及病毒性心肌炎自身免疫反應(yīng)發(fā)病機(jī)制、診斷、治療等的重要基礎(chǔ)，常用的誘導(dǎo)方法有心肌自身抗原、心肌自身抗原表位、活化自身免疫細(xì)胞等[16]，不同的誘導(dǎo)方式在病理改變和病情嚴(yán)重程度方面有所差異。有日本學(xué)者采用豬的心肌球蛋白成功誘導(dǎo)了EAM大鼠模型[17]，其發(fā)展進(jìn)程與人巨細(xì)胞性心肌炎類似，且可進(jìn)展為DCM，是較為理想的模型。本次研究即采用這種方法，給予Lewis大鼠純化的豬心肌肌球蛋白乳濁液皮下注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心功能指標(biāo)LVEF、LVFS水平明顯降低，LVIDd、LVIDs水平顯著升高，HE染色結(jié)果也顯示心肌大量炎性細(xì)胞浸潤間質(zhì)、肌束間，存在小血管擴(kuò)張充血，提示EAM模型建立成功，而經(jīng)三七總皂苷干預(yù)后，上述的心功能指標(biāo)均得到明顯改善，心肌組織病理學(xué)評分也較模型組顯著降低，表明三七總皂苷確實(shí)能夠減輕EAM大鼠炎癥改變，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，并且治療作用與藥物劑量有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是引起心肌損傷的方式之一。細(xì)胞凋亡涉及到內(nèi)源性、外源性兩條重要的途徑，其中Bcl-2蛋白家族主要調(diào)控的線粒體介導(dǎo)內(nèi)源性凋亡途徑在細(xì)胞凋亡研究中最受重視。Bcl-2蛋白家族包括兩類蛋白，Bcl-2主要在神經(jīng)和淋巴系統(tǒng)表達(dá)，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用；而Bax在各種組織廣泛表達(dá)，不僅能拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，還能直接加速細(xì)胞凋亡。有研究稱[18-21]，免疫性心肌炎過程中有心肌細(xì)胞凋亡存在，而多種心臟病心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控與Bcl-2和Bax有關(guān)。本次研究結(jié)果中模型組心肌組織Bcl-2表達(dá)水平較對照組降低，Bax表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率較對照組升高也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Caspase-3為凋亡途徑關(guān)鍵效應(yīng)分子[22-25]，兩條細(xì)胞凋亡途徑最后都會引起Caspase-3活化，剪切多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP，使核小體間的DNA裂解而引起細(xì)胞凋亡，也標(biāo)志著細(xì)胞凋亡浸入不可逆階段[26-29]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率較低，心肌組織Bcl-2表達(dá)水平較高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平較低，且三七總皂苷干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系，表明三七總皂苷能有效促進(jìn)EAM大鼠心肌組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌損傷減輕。

綜上所述，三七總皂苷能劑量依賴性的改善EAM大鼠心功能，減輕心肌炎癥病理變化，抑制細(xì)胞凋亡，其作用可能與調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。