倪廣曉，段春巧，周宏斌，孟 然，王曉青，王 璞

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

腦卒中已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的首位因素，其中缺血性腦卒中約占80%左右，其帶來的功能障礙嚴重影響生存質(zhì)量[1]。神經(jīng)再生是恢復(fù)缺血性腦卒中后神經(jīng)功能障礙的關(guān)鍵，神經(jīng)功能的改善是以認知功能的恢復(fù)為基礎(chǔ)的，因此，改善腦缺血損傷后的認知功能成為關(guān)注的焦點，認知功能主要包括記憶、學(xué)習(xí)、空間感知等[2-4]。在成年哺乳動物及人類中，海馬齒狀回顆粒細胞下層也是神經(jīng)再生的主要區(qū)域之一[4-5]。在齒狀回顆粒細胞下層神經(jīng)干細胞能夠維持不斷的自我更新、增殖，分化為成熟神經(jīng)細胞，維持大腦功能的正常運轉(zhuǎn)[5-7]。腦缺血損傷能夠刺激齒狀回顆粒細胞下層內(nèi)源性神經(jīng)再生[8-9]，然而這種內(nèi)源性的神經(jīng)再生對于彌補神經(jīng)功能缺損還是杯水車薪。因此，促進內(nèi)源性神經(jīng)再生成為研究的熱點。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)和血生絡(luò)方能夠?qū)δX缺血再灌注損傷大鼠發(fā)揮腦保護作用，并促進腦缺血再灌注損傷后的血管新生[10]。前期的臨床研究表明和血生絡(luò)方能夠改善缺血性腦卒中患者的肢體運動功能和平衡功能，并且能夠促進外周血中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達[11]。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與其特異性受體酪氨酸激酶受體B(Trk B)結(jié)合，BDNF-Trk B信號通路與大腦中神經(jīng)再生過程密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們通過建立腦缺血大鼠模型，進一步探討和血生絡(luò)方是否通過調(diào)控BDNF-Trk B信號通路促進腦缺血后齒狀回顆粒細胞下層神經(jīng)再生從而改善認知功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠，體重260～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號:SCXK(京)2016-0011。實驗室通風(fēng)良好，維持室溫(22±3)℃、相對濕度(60±5)%，大鼠自由進食水及活動，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 和血生絡(luò)方制備 和血生絡(luò)方組成及制備：黃芪、人參、天麻、川芎、當歸、丹參、紅景天、白芍、熟地、黃芩，以8∶1∶2∶1.5∶2∶1∶2∶1.5∶1∶1的干重比例混合，制備成濃縮水提液，終濃度2 g/ml，4 ℃冰箱保存。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》中人與大鼠體表面積折算等效劑量比值為0.018換算公式drat=dhuman×0.018/0.2 kg，我們確定大鼠的劑量為18.9 g/(kg·d)。大鼠于造模麻醉清醒后開始灌胃給藥。

1.3 主要儀器 SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，Kopf 腦立體定位儀，Morris 水迷宮(上海吉量軟件科技公司)；Olympus 生物顯微鏡IX73型、低溫離心機5417R型、Bio-Rad定量PCR 儀；Bio-Rad 電泳儀、Bio-Rad 半干轉(zhuǎn)膜儀及UVP 凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 試劑和藥品 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brd U)(Sigma公司)；兔抗巢蛋白(Nestin)多克隆抗體(Abcam公司)；大鼠抗雙皮質(zhì)素(DCX)多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology 公司)；兔抗Trk B 單克隆抗體(Abcam公司)；大鼠抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brd U)單克隆抗體(Bio Legend公司)；BDNF單克隆抗體(Proteintech公司)；Dy Light 488標記山羊抗兔IgG(Abbkine公司)；Dy Light 549 標記山羊抗大鼠IgG(Abbkine 公司)；兔抗β-actin多克隆抗體(萬類生物科技公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物模型制作：參照改良Zea-Longa大腦中動脈缺血造模方法(MCAO)。具體步驟如下：麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于操作臺上。頸部備皮，常規(guī)消毒鋪手術(shù)巾，取頸部正中切口，長約1 cm，切開皮膚，鈍性分離頸部筋膜及頸闊肌，小心分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌，顯露右側(cè)頸三角，暴露右頸總動脈，仔細游離右側(cè)頸總動脈(CCA)及迷走神經(jīng)。將頸外動脈(ECA)遠心端結(jié)扎，近心端輕輕結(jié)扎備用，在距CCA分叉近端0.5 cm處動脈夾完全夾閉CCA，動脈夾完全夾閉頸內(nèi)動脈(ICA)，沿著ECA遠端結(jié)扎處剪以V型小口，將ECA殘端沿著ICA拉直，將一根直徑0.2 mm頭端圓鈍尼龍絲線插入動脈，經(jīng)頸總動脈分叉處通過頸內(nèi)動脈入顱至大腦中動脈的起始部以阻斷大腦中動脈血流，插入深度為(18.5±0.5) mm，結(jié)扎ECA進線處，放松CCA動脈夾，止血，縫合皮膚，外留1 cm長線栓，將大鼠側(cè)臥置于籠內(nèi)，保證大鼠可以自由攝食水。大鼠清醒前均給予白熾燈(100 W)照射，保持肛溫36 ℃左右。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不做任何損傷血管操作。和血生絡(luò)方+抑制劑組先將大鼠麻醉，固定并進行右側(cè)側(cè)腦室立體定位灌注(以前囪為基點，前：0.8 mm，右側(cè)：1.5 mm，深：3.5 mm)，采用微量注射器20 min勻速注入5 μl k252a(k252a溶于1% 二甲基亞砜溶液中稀釋至濃度為25 mmol/L)。注射完畢后，將針頭與注射器留置2 min，取下針頭，用骨蠟封閉顱骨孔，縫合皮膚，然后行MCAO操作。

1.5.2 MCAO大鼠模型的評價：參照“Zea-Longa”評分標準進行神經(jīng)功能缺損評分，0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：病灶對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：向病灶對側(cè)自發(fā)性旋轉(zhuǎn)；3分：向病灶對側(cè)傾倒；4分：無自發(fā)性行走且出現(xiàn)意識喪失。1～3分者視為有效模型，0分及4分者予以剔除，動物出現(xiàn)死亡及造模不成功時隨時進行補充。

1.5.3 動物分組：假手術(shù)組動物接受假手術(shù)和等體積的0.9%氯化鈉溶液；模型組：動物接受MCAO處理；和血生絡(luò)方組：動物接受MCAO處理；和血生絡(luò)方+抑制劑組：動物接受腦室注射k252a后行MCAO處理。k252a是BDNF-Trk B信號通路的特異性抑制劑[12],它通過降低Trk B磷酸化水平并抑制BDNF的分泌，從而使神經(jīng)干細胞的增殖減少[13]。高濃度k252a可抑制BDNF-Trk B信號通路，低濃度k252a可促進內(nèi)源性BDNF分泌[13]。本實驗采用5 μl高濃度k252a注入大鼠側(cè)腦室。

1.5.4 給藥方法和途徑：假手術(shù)組和模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液4 ml/(kg·d)，1次/d，共14 d。和血生絡(luò)方組與和血生絡(luò)方+抑制劑組灌胃給予和血生絡(luò)方18.9 g/(kg·d)，1次/d，共14 d。MCAO術(shù)后，給予腹腔注射Brd U 50 mg/(kg·d)，連續(xù)14 d，假手術(shù)組大鼠也給予相同操作。

1.6 檢測指標

為了滿足能耗越小、旅行時間差越小和個體適應(yīng)度越大的需要，選擇以下適應(yīng)度函數(shù)Fit進行多列車遺傳優(yōu)化算法的研究：

1.6.1 腦梗死體積百分比測定：采用TTC染色法測定腦梗死體積。分別于MCAO術(shù)后(Post MCAO day,PMD) 1、3、7 d進行，將大鼠麻醉后斷頭并快速完整取出腦組織。將取出的腦組織放入-20 ℃冰箱中冷凍10 min，然后從額極開始連續(xù)等距切取5個冠狀腦片(厚度2 mm)，置于2%的TTC染色溶液中避光孵育15 min。待腦片均勻著色后放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。數(shù)碼相機拍照，然后應(yīng)用Image-Pro Plus 5.1軟件進行圖像分析。計算水腫修正后梗死體積百分比(%)= [總梗死體積-(梗死側(cè)半球體積-梗死對側(cè)半球體積)]/梗死對側(cè)半球體積×100%[14]。

1.6.2 mirror水迷宮實驗:所有大鼠在MCAO術(shù)后第3天開始進行水迷宮實驗。水迷宮為直徑145 cm圓柱形水池，水溫保持在(22±0.5) ℃，保持周圍環(huán)境安靜。第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，第2～5天作為正式實驗。

1.6.3 定位巡航行實驗:每日上午同一時間點將大鼠從4個不同象限放入水中，訓(xùn)練4次，每次間隔15～20 min，連續(xù)5 d。檢測時間設(shè)置為60 s，記錄大鼠尋找并爬上柱狀平臺的時間(逃避潛伏期)。每日計算各組大鼠從4個不同象限入水的逃避潛伏期的平均值。

1.6.4 空間探索實驗：在定位巡航行實驗結(jié)束后，移除柱狀平臺，將大鼠從東南象限池壁弧形中點放入水中，記錄各組大鼠在120秒內(nèi)穿越柱狀平臺位置的次數(shù)。

1.6.5 免疫熒光染色：在PMD3、PMD7、PMD14，大鼠麻醉后灌注取腦，經(jīng)多聚甲醛固定后蔗糖溶液梯度脫水，冰凍切片機進行連續(xù)冰凍切片，片厚10 μm。切片在4 ℃下用以下一抗孵育過夜：山羊抗Nestin(1∶50)、山羊抗DCX(1∶100)和小鼠抗Brd U(1∶150)，在4 °C下過夜。然后在暗室內(nèi)加入Dylight 488大鼠抗山羊(1∶200)和Dylight 594 IgG兔抗小鼠(1∶200)孵育2 h后DAPI重染細胞核。顯微鏡觀察齒狀回顆粒細胞下層Brd U+/Nestin+和Brd U+/DCX+細胞表達并拍攝圖像。用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析。

1.6.6 細胞計數(shù)：由1名對實驗設(shè)計不了解的觀察者進行細胞計數(shù)。應(yīng)用Olympus共焦激光掃描顯微鏡在放大400倍條件下分析雙標切片。每個切片中隨機選擇10幅圖像，間隔大于1 μm，用Image J軟件對Brd U+/Nestin+細胞和Brd U+/DCX+細胞進行計數(shù)，并計算每幅圖的平均數(shù)。

1.6.7 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-PCR) 檢測齒狀回顆粒細胞下層中Nestin、DCX、BDNF和Trk B的mRNA表達:在PMD3、PMD7、PMD14，將大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，于冰上分離出齒狀回顆粒細胞下層組織，保存液氮之中。冷凍后的齒狀回顆粒細胞下層組織用1 ml三唑試劑和超聲儀勻漿。將勻漿在室溫下孵育5 min以分離核蛋白復(fù)合物。然后加入0.2 ml氯仿，劇烈搖晃勻漿，室溫孵育5 min，然后在4 ℃10000 g離心10 min，將含有RNA的水相與0.5 ml異丙醇混合，室溫下孵育10 min，在4 ℃下10000 g離心10 min，再懸浮于75%乙醇中，3500 g于4 ℃離心5 min，干燥后溶于20 μl 0.1%DEPC水(用焦碳酸二乙酯處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的去離子水,其pH值約為7.4)中。室溫下加入30 μl無核糖核酸酶ddH2O 2 min，混勻，沉淀完全溶解，得到樣品總RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以β-actin 為內(nèi)參，在實時熒光定量PCR儀上擴增進行反應(yīng)，引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。記錄CT值作為統(tǒng)計參數(shù)，用比較2-△△CT法計算mRNA相對表達水平。

表1 基因及其引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 和血生絡(luò)方對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 見表2。 TTC染色結(jié)果分析顯示，在PMD1和PMD3，接受和血生絡(luò)方治療的MCAO大鼠的腦梗死體積明顯小于模型組大鼠(均P<0.05)。在PMD1、PMD3和PMD7，和血生絡(luò)方組、和血生絡(luò)方+抑制劑組的腦梗死體積比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較(mm3)

2.2 和血生絡(luò)方對MCAO大鼠認知功能的影響 水迷宮實驗結(jié)果顯示隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠的逃避潛伏期逐漸縮短。與模型組比較，和血生絡(luò)方組大鼠在第2、3、4、5 天的逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05)。并且，和血生絡(luò)方組大鼠逃避潛伏期也顯著低于和血生絡(luò)方+抑制劑組(P<0.05)。空間探索實驗結(jié)果顯示模型組大鼠穿越平臺次數(shù)較假手術(shù)組顯著減少(P<0.05)；給予和血生絡(luò)方干預(yù)的MCAO大鼠的穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)，而和血生絡(luò)方+抑制劑組大鼠的穿越平臺次數(shù)顯著低于和血生絡(luò)方組。見表3。

表3 大鼠水迷宮實驗結(jié)果

2.3 和血生絡(luò)方對MCAO大鼠齒狀回顆粒細胞下層神經(jīng)再生的影響 見表4(圖1～3)。免疫熒光結(jié)果顯示，在PMD3、PMD7和PMD14，與模型組和和血生絡(luò)方+抑制劑組比較，和血生絡(luò)方組顯著增加了Brd U+/Nestin+細胞和Brd U+/DCX+細胞在齒狀回顆粒細胞下層的表達(P<0.05)。 RT-PCR結(jié)果表明，在PMD3、PMD7和PMD14，與模型組相比，和血生絡(luò)方組大鼠齒狀回顆粒細胞下層DCX的mRNA表達水平均顯著增高(P<0.05)，而和血生絡(luò)方+抑制劑組DCX的mRNA表達水平均顯著低于和血生絡(luò)方組。Western blot結(jié)果顯示，在PMD3、PMD7和PMD14，和血生絡(luò)方組大鼠DCX蛋白表達水平顯著高于模型組和和血生絡(luò)方+抑制劑組，與RT-PCR結(jié)果顯示出相似的趨勢。

表4 各組大鼠DCX蛋白及DCX mRNA表達水平比較

2.4 和血生絡(luò)方對BDNF-Trk B-LIMK信號通路表達的影響 見表5、6(圖3)。為了進一步明確和血生絡(luò)方影響腦缺血大鼠齒狀回顆粒細胞下層神經(jīng)再生的機制，應(yīng)用Western blot和RT-PCR檢測MCAO大鼠患側(cè)齒狀回顆粒細胞下層組織中BDNF和Trk B表達水平。結(jié)果顯示，腦缺血后刺激內(nèi)源性BDNF的表達水平增加。與模型組相比，在PMD3、PMD7和PMD14，和血生絡(luò)方組顯著增加齒狀回顆粒細胞下層的 BDNF和Trk B表達(P<0.05)，而和血生絡(luò)方+抑制劑組的BDNF和Trk B表達水平均明顯低于和血生絡(luò)方組(P<0.05)。

表5 各組大鼠BDNF、Trk B蛋白表達水平比較

表6 各組大鼠BDNF、Trk B mRNA表達水平比較

A:假手術(shù)組；B:模型組；C：和血生絡(luò)方組；D：和血生絡(luò)方+抑制劑組。藍色為細胞核，綠色為Nestin，紅色為Brd U，綠色和紅色重疊的細胞為Brd U/Nestin+細胞圖1 各組大鼠不同時間點齒狀回顆粒細胞下層Brd U/Nestin+細胞(免疫熒光染色，×400)

A:假手術(shù)組；B:模型組；C：和血生絡(luò)方組；D：和血生絡(luò)方+抑制劑組。藍色為細胞核，綠色為DCX，紅色為Brd U，綠色和紅色重疊的細胞為Brd U/DCX+細胞圖2 各組大鼠不同時間點齒狀回顆粒細胞下層Brd U/DCX+細胞(免疫熒光染色，×400)

A:假手術(shù)組；B:模型組；C：和血生絡(luò)方組；D：和血生絡(luò)方+抑制劑組圖3 各組大鼠不同時間點齒狀回顆粒細胞下層Nestin、DCX、BNDF、Trk B蛋白表達

3 討 論

缺血性卒中屬于中醫(yī)學(xué)中風(fēng)病范疇。中醫(yī)學(xué)對中風(fēng)病的描述最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，認為中風(fēng)病的發(fā)生與“正氣不足，外受風(fēng)邪”有關(guān)。漢代張仲景的中風(fēng)理論重在外感“虛邪賊風(fēng)，邪客半身”。唐代以前醫(yī)家均認為中風(fēng)病病機為內(nèi)傷正虛，外風(fēng)入侵。宋金元時期，風(fēng)、火、痰、濕“內(nèi)風(fēng)”致病論興起。

而明清時期的中風(fēng)病病機又發(fā)生了變化，《景岳全書·非風(fēng)》中記載：“內(nèi)傷積損，頹敗而然”，重視內(nèi)傷導(dǎo)致中風(fēng)。清代王清任在《醫(yī)林改錯》中記述：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，由此開創(chuàng)了“益氣活血”法治療中風(fēng)病，對近現(xiàn)代影響較大,近代醫(yī)家也有許多針對腦卒中病因病機的總結(jié)[15]。本研究的和血生絡(luò)方組方依據(jù)《素問·脈要精微論》：“脈為血之府” “血之精為絡(luò)”和《素問·調(diào)經(jīng)論》：“病在脈，調(diào)之血；病在血，調(diào)之絡(luò)”以及《靈樞·本臟》中 “血和則經(jīng)脈流行”等理論，認為中風(fēng)病位在腦脈，中風(fēng)后的病機為氣血失和、腦中脈絡(luò)失于濡養(yǎng)，中風(fēng)日久，則氣血俱虛。治療應(yīng)著重養(yǎng)血活血，輔以益氣生血行血。因此，提出“和血生絡(luò)法”治療中風(fēng)，和血生絡(luò)法“生” “通”并用，其中“和血”意在養(yǎng)血、活血，使新血及新絡(luò)生而瘀血去，益氣能夠統(tǒng)血固血，使血行有度，新血絡(luò)的生成也使氣行有道。因此，通過養(yǎng)血活血益氣，促進中風(fēng)后腦絡(luò)損傷的修復(fù)和新血、新絡(luò)的生成，這也與促進腦卒中后側(cè)支循環(huán)建立為神經(jīng)再生搭建橋梁的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究熱點不謀而合。基于上述理論，我們在補陽還五湯的基礎(chǔ)上化裁出和血生絡(luò)方。

認知功能障礙是缺血性腦卒中的常見功能缺陷，認知功能的改善也是神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)和前提。本研究采用MCAO模型大鼠更接近于臨床中的缺血性腦卒中，大腦中動脈供血減少會引起海馬神經(jīng)細胞的凋亡和壞死。海馬屬于原始皮層，在學(xué)習(xí)、記憶及空間感知方面發(fā)揮重要作用[16-17]。海馬的CA1區(qū)對缺血缺氧尤其敏感，因此，MCAO大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞容易出現(xiàn)損傷，并引起一系列神經(jīng)功能障礙[5,18-19]。研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后認知功能障礙的嚴重程度與海馬區(qū)受損神經(jīng)細胞的數(shù)目密切相關(guān)[20]。腦缺血能夠誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身修復(fù)機制，啟動內(nèi)源性神經(jīng)再生，在哺乳動物和人類中，海馬的齒狀回顆粒細胞下層是神經(jīng)再生的主要部位之一[21-23]。

本研究應(yīng)用和血生絡(luò)方對MCAO大鼠進行干預(yù)，應(yīng)用TTC染色法觀察和血生絡(luò)方對腦缺血大鼠梗死體積的影響，結(jié)果顯示和血生絡(luò)方顯著降低MCAO的梗死體積，發(fā)揮腦保護作用。水迷宮實驗檢測結(jié)果顯示模型組逃避潛伏期延長，跨越平臺次數(shù)顯著減少，和血生絡(luò)方組MCAO大鼠的逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)接近假手術(shù)組。與和血生絡(luò)方組比較，和血生絡(luò)方+抑制劑組 MCAO大鼠的逃避潛伏期顯著增加，跨越平臺次數(shù)明顯減少?？梢姡脱j(luò)方能夠顯著改善MCAO大鼠的認知功能。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和血生絡(luò)方能夠促進MCAO大鼠齒狀回顆粒細胞下層Brd U+/Nestin+和Brd U+/DCX+細胞的表達，在PMD3至PMD14呈逐漸上升趨勢。和血生絡(luò)方+抑制劑組MCAO大鼠齒狀回顆粒細胞下層Brd U+/Nestin+和Brd U+/DCX+細胞的表達明顯低于和血生絡(luò)方組，說明k252a抑制了和血生絡(luò)方調(diào)控BDNF-Trk B信號通路的作用。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nestin和DCX的mRNA表達和蛋白表達顯示出相似的趨勢。

BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，而Trk B是BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的特異性受體。BDNF與Trk B的特異性結(jié)合在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)自我更新過程中發(fā)揮重要作用。k252a是BDNF-Trk B信號通路的特異性抑制劑，能夠降低Trk B磷酸化的程度，Trk B的磷酸化程度降低又能抑制內(nèi)源性BDNF的分泌[12-13]。有研究表明，高濃度的k252a可以抑制BDNF-Trk B通路表達，而低濃度的k252a可以促進內(nèi)源性BDNF的分泌。本研究應(yīng)用高濃度的k252a干預(yù)MCAO大鼠，結(jié)果顯示BDNF和Trk B的表達同時降低。Colino等[24]研究發(fā)現(xiàn)，敲除BDNF基因小鼠的大腦中神經(jīng)干細胞增殖率顯著低于正常小鼠，并且還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞在分化和成熟前大量凋亡。Fang等[25]發(fā)現(xiàn)，敲除Trk B基因的小鼠，其大腦神經(jīng)干細胞的增殖和分化速度顯著降低。本研究結(jié)果表明，和血生絡(luò)方顯著增加了MCAO大鼠齒狀回顆粒細胞下層BDNF和Trk B的表達，在和血生絡(luò)方和k252a的共同干預(yù)時，BDNF-Trk B信號通路表達明顯受到抑制。

綜上所述，和血生絡(luò)方可以改善腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)、記憶和空間定位能力，其作用機制與其調(diào)控BDNF-Trk B信號通路表達，促進海馬齒狀回顆粒細胞下層神經(jīng)再生水平密切相關(guān)。