謝江濤,馮樂宵,王世鋒,劉振鋒,李云翔

(1.咸陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 咸陽712000;2.乾縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 乾縣713300)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤瘤體的快速生長和增殖需要消耗大量氧氣，因此瘤體處于一種相對低氧的狀態(tài)，在這種低氧條件下低氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達增高，從目前的研究得知HIF-1α應對低氧微環(huán)境時，能調(diào)節(jié)多種涉及低氧應激下細胞適應和存活的靶基因，增加其轉(zhuǎn)錄活性并表達相應的產(chǎn)物以適應低氧應激反應[1]。HIF-1α的表達受到了諸多因素的影響，因此對HIF-1α的調(diào)控成為膠質(zhì)瘤適應低氧微環(huán)境的核心點?；钚匝?Reactive oxygen species,ROS)就有可能是影響HIF-1α表達的因素之一，但相關機制仍不清楚。本實驗擬于常氧(常規(guī)培養(yǎng)箱)及低氧(氯化鈷化學低氧法)條件下培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細胞并應用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)研究ROS對HIF-1α表達水平的調(diào)節(jié)，為進一步研究低氧條件下膠質(zhì)瘤的生物學行為及治療靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 膠質(zhì)瘤SHG-44瘤株購于中國科學院上海細胞研究所，NAC、氯化鈷(CoCl2)均購于Sigma公司，ROS檢測試劑盒購于碧云天公司，HIF-1α引物設計由Primer 5.0軟件完成，引物合成由北京三博遠志生物技術有限公司合成，RNA提取試劑盒、RT-PCR檢測全套試劑盒購于Fermentas公司。5% CO2培養(yǎng)箱(型號THERMO371)，流式細胞分析儀(美國BD FACSCalibur，型號DICKIN SON)，多重實時熒光定量PCR儀(型號Bio-Rad iQTM5)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞系培養(yǎng)與傳代：SHG-44膠質(zhì)瘤細胞采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后傳代(1∶2)。

1.2.2 CoCl2化學法模擬低氧：5% CO2細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)SHG-44瘤株的基礎上在DMEM細胞培養(yǎng)液中加入CoCl2溶液(終濃度150 μmol/L共培養(yǎng)24 h)，阻斷細胞中氧信號的轉(zhuǎn)導，模擬低氧信號。

1.2.3 實驗分組：常氧對照組，常氧條件下培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細胞；常氧NAC干預組，常氧條件下培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細胞+NAC；低氧對照組，CoCl2化學法模擬低氧條件培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細胞；低氧NAC干預組，CoCl2低氧法培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細胞+NAC。

1.2.4 MTT法檢測CoCl2化學法模擬低氧環(huán)境后細胞增殖情況：取對數(shù)生長期的SHG-44 膠質(zhì)瘤細胞，制成4×104細胞/ml細胞懸液,接種于96孔板,每孔100 μl(設5個復孔),每孔添加100 μl CoCl2溶液，并使各孔終濃度為150 μmol/L。培養(yǎng)24 h后檢測OD值。

1.2.5 按預設實驗分組加入CoCl2和(或)NAC：四組每組一塊6孔板，一塊Double well雙孔玻片。取處于對數(shù)生長期的SHG-44膠質(zhì)瘤細胞，制成4×104細胞/ml細胞懸液,接種于6孔板,每孔3 ml,低氧對照組及低氧NAC干預組次日每孔補加1 ml含CoCl2DMEM培養(yǎng)液(600 μmol/L)，使CoCl2終濃度為150 μmol/L;常氧對照組及常氧NAC干預組次日每孔補加1 ml DMEM培養(yǎng)液。同時稀釋細胞懸液為2×104細胞/ml,接種于Double well雙孔玻片,每孔200 μl，低氧對照組及低氧NAC干預組次日小心吸棄上清，并補加200 μl含氯化鈷DMEM培養(yǎng)液(150 μmol/L)，常氧對照組及常氧NAC干預組次日小心吸棄上清，并補加DMEM培養(yǎng)液200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后常氧NAC干預組和低氧NAC干預組各孔加入活性氧的抑制劑NAC(終濃度為10 mmol/L)，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.6 各組細胞ROS表達檢測：配制熒光探針DCFH-DA，取DCFH-DA(10 mmol/L)5 μl加入5 ml無血清DMEM培養(yǎng)基中(1∶1000)，四組六孔板到達培養(yǎng)時間后，每孔加入500 μl熒光探針DCFH-DA(1∶1000),混勻后繼續(xù)放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，以使DCFH-DA進入細胞后被細胞內(nèi)的ROS氧化為有熒光的DCF。使用流式細胞儀檢測DCF的熒光(488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長)以檢測胞內(nèi)ROS的水平。

1.2.7 各組細胞HIF-1α mRNA表達檢測：四組六孔板到達培養(yǎng)時間后轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中(冰浴中完成)，RNA提取試劑盒(RNAfast 200)快速抽提RNA。取抽提的總RNA 5 μl，mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄反應液(cDNA)1 μl作為模板進行擴增反應，其中引物設計,見表1。RT-PCR 反應條件為：50 ℃、2 min 1個循環(huán)，95 ℃、10 min 1個循環(huán)，變性 95 ℃、15 s，退火 60 ℃、30 s，延伸 72 ℃、30 s，共40個循環(huán)。設定反應條件后置于多重實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad iQTM5)中進行反應，到時間中止反應后分析實驗數(shù)據(jù)，計算目的基因的相對變化量。目的基因的相對變化量2-△△CT=2-(實驗組目的基因-實驗組參照基因)/(對照組目的基因—對照組參照基因)。

表1 HIF-1α及β-actin引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析實驗數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)之間應用方差分析進行比較(數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗符合方差齊性)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測CoCl2化學法模擬低氧環(huán)境后細胞增殖情況 常氧組隨著NAC濃度梯度增大，NAC在0～5 mmol/L濃度，細胞的吸光度(OD值)升高(均P<0.05)，而濃度增大至10、15 mmol/L時細胞的吸光度(OD值)下降(均P<0.05)；然而0 mmol/L組與10 mmol/L組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。低氧組隨著NAC濃度梯度增大，NAC在0～5 mmol/L濃度，細胞的吸光度(OD值)無明顯變化(均P>0.05)，而濃度增大至10 mmol/L及15 mmol/L細胞的吸光度(OD值)明顯下降(均P<0.05)。提示低氧條件下NAC在一定濃度范圍內(nèi)對細胞活力沒有太大影響，但在較大濃度時(>10 mmol/L)則對細胞活力影響較大。見表2。

表2 常氧及低氧組不同濃度NAC作用后細胞增殖OD值

2.2 各組細胞ROS表達情況比較 常氧對照組ROS表達低于低氧對照組(P<0.05)，常氧NAC干預組ROS表達低于常氧對照組(P<0.05)，低氧NAC干預組ROS表達低于低氧對照組(P<0.05)。結(jié)果提示低氧條件下培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞ROS表達水平明顯高于常氧條件培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞，而且應用ROS的干預劑NAC后可明顯降低常氧及低氧培養(yǎng)條件下的ROS表達。見表3。

表3 各組細胞ROS表達情況比較

2.3 各組細胞HIF-1α mRNA表達情況比較 低氧組HIF-1α mRNA表達高于常氧組(均P<0.05)，低氧組HIF-1α mRNA表達高于常氧NAC干預組及低氧NAC干預組(均P<0.05)。常氧組HIF-1α mRNA表達與常氧NAC干預組及低氧NAC干預組比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，低氧NAC干預組HIF-1α mRNA表達與常氧NAC干預組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組HIF-1α mRNA相對表達量比較

3 討 論

HIF-1α是Wang 和Semenza于1992年從缺氧的Hep-3細胞核中首次提取分離出缺氧誘生的并具有DNA結(jié)合活性的一種轉(zhuǎn)錄因子，腫瘤的惡性增殖使其組織內(nèi)耗氧及血管形成不全，導致微環(huán)境含氧量不足，使腫瘤各區(qū)域處于不同的低氧微環(huán)境中[2]。HIF-1α應對低氧微環(huán)境時，能調(diào)節(jié)多種涉及低氧應激下細胞適應和存活的靶基因，增加其轉(zhuǎn)錄活性并表達相應的產(chǎn)物以適應低氧應激反應[3-4]。

從目前的研究得知HIF-1β持續(xù)性穩(wěn)定表達于胞質(zhì)中，不受缺氧及其他因素的調(diào)節(jié)和干擾，對HIF-1α的調(diào)控分為HIF-1α降解水平的調(diào)節(jié)和影響HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)[5-6]。HIF-1α降解水平的調(diào)節(jié)目前研究的相對較多，尤其是pHDs-pVHL——泛素化蛋白水解酶降解途徑研究的比較透徹了[7]，此外還有一些其他降解途經(jīng)，例如OS-9[8-9]促進脯氨酸羥化酶誘發(fā)的依賴pVHL的泛素化蛋白水解酶降解途徑。而關于影響HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)目前相關報道較少，Steffen等[10]發(fā)現(xiàn)GSK3β通過抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄起始因子eIF2B，使HIF-1α的mRNA表達水平降低，GSK3β的抑制劑靛玉紅可明顯提高HIF-1α mRNA表達水平。

本研究中低氧條件下培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞ROS表達水平明顯高于常氧條件培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞，而且應用ROS的干預劑NAC后可明顯降低常氧及低氧培養(yǎng)條件下的ROS表達。而Alex等[11]也認為腫瘤細胞內(nèi)ROS升高可能是一種參與調(diào)控HIF-1α的重要因素。ROS可能作為一種特殊的第二信使參與信號轉(zhuǎn)導及影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，啟動多種細胞生物學效應[12-13]。ROS是線粒體的電子轉(zhuǎn)運鏈在運氧過程中電子遺漏，基態(tài)氧通過轉(zhuǎn)運鏈時接受漏出的電子變?yōu)镽OS，腫瘤組織因生長失控，其內(nèi)部處于一種相對低氧的狀態(tài)，因此線粒體有氧呼吸電子轉(zhuǎn)運鏈有可能因受阻而產(chǎn)生ROS[14-15]。因此可以得出SHG-44膠質(zhì)瘤細胞于低氧條件下培養(yǎng)時ROS表達水平明顯高于常氧條件培養(yǎng)，然而給予抗氧化劑NAC之后兩組ROS表達水平均明顯下降。

本次試驗中低氧條件下HIF-1α mRNA表達水平高于常氧條件下，但是應用抗氧化劑NAC后HIF-1α mRNA表達下降。而Koshikawa等[16]的研究也指出ROS可能通過激活PI3K-PKB/Akt通路進而影響HIF-1α的表達。PI3K-PKB/Akt通路并非直接調(diào)節(jié)HIF-1α的表達和穩(wěn)定性，它有很多的下游調(diào)節(jié)靶點，可以間接調(diào)節(jié)HIF-1α的表達。mTOR可通過改變翻譯調(diào)節(jié)因子真核細胞啟動因子4E結(jié)合蛋白 (4E-BP1)和核糖體p70S6激酶1(p70S6K1)的磷酸化狀態(tài)啟動HIF-1α翻譯過程，而HIF-1α的一種下游靶基因產(chǎn)物REDD1卻可以抑制mTOR的活性，從而下調(diào)HIF-1α的表達水平，這也是HIF-1α自身的一種負反饋調(diào)節(jié)機制[17]。Brooke等[18]認為低氧條件下p38MAPK的激活有賴于線粒體產(chǎn)生的ROS，ROS可以使MAPK的上游激酶(MAPKKK)的絲氨酸和蘇氨酸位點的磷酸化進而激活p38MAPK信號通路[19-20]。因此也可以推斷出這樣一個結(jié)論，即抗氧化劑NAC可使膠質(zhì)瘤細胞中HIF-1α mRNA表達下降，進而可使HIF-1α生成減少，使得膠質(zhì)瘤細胞適應低氧應激反應的能力下降，可以起到抑制膠質(zhì)瘤細胞生長的作用。

本研究明確了膠質(zhì)瘤細胞在低氧條件下ROS表達水平及HIF-1α mRNA表達水平明顯高于常氧條件，但是應用ROS干預劑NAC之后低氧條件下SHG-44膠質(zhì)瘤細胞中HIF-1α mRNA表達下降，提示ROS在促進HIF-1α mRNA表達中起某種重要作用，而抗氧化劑NAC可阻斷這種作用，因此也提示在腦膠質(zhì)瘤的其他輔助治療中抗氧化劑也可以起到抑制膠質(zhì)瘤細胞生長的作用，這為進一步研究抗氧化劑在膠質(zhì)瘤輔助治療中的應用提供了新的思路。