李 靜，趙 濤，梁亞萍，仵倩紅

(陜西省結(jié)核病防治院,陜西 西安710100)

泌尿系結(jié)核(Tuberculous urinary，UTB)是臨床上一種常見的肺外結(jié)核，被認為是一種嚴重的肺外結(jié)核(EPTB)[1-2]，全年約占EPTB病例中的30%～40%，在發(fā)展中國家位居肺外結(jié)核的第二位[3]。UTB起病隱匿，表現(xiàn)具有多態(tài)性與其他細菌感染癥狀相似，臨床癥狀不明顯和缺乏特異性，而且通常在疾病的晚期出現(xiàn)癥狀，是UTB患者診斷延遲和治療效果不佳的主要原因[4]。目前篩查較好的尿路造影(CTU)及磁共振泌尿系統(tǒng)水成像技術(shù)(MRU)[5]大多基層并未開展，所以對于基層臨床診斷除了典型的臨床癥狀最重要的還是依賴于傳統(tǒng)的細菌學檢測方法。實驗室診斷UTB常用的檢測方法是：抗酸桿菌(AFB)涂片和分枝桿菌培養(yǎng)[4,6]。AFB涂片雖然快速、價低，但是尿液標本陽性檢出率及敏感性都很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長、不能滿足臨床早期、快速診治的需求，故尋求一種新的快速、準確且高敏感度和高特異度的實驗室診斷方法成為UTB檢測工作的重要目標。GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert)是以全自動半巢式實時PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因為靶基因，在2 h內(nèi)同時快速檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥。2013年GeneXpert檢測作為新型分子診斷技術(shù)被WHO推薦用于肺外結(jié)核的診斷[7]。但目前GeneXpert用于尿液樣本的數(shù)據(jù)有限，本研究中，通過分析AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert檢測對UTB的診斷效能，進一步評估MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測對UTB的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集2019年1-12月陜西省結(jié)核病防治院收治的185例疑似UTB患者尿液標本的實驗室檢測資料，納入同時采用AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng) 和GeneXpert檢測的112例疑似UTB患者，所有患者臨床確診資料均來源于臨床原始病例記錄。泌尿系結(jié)核患者診斷依據(jù)(符合下列三項任何一項者，即可確診[8]：尿結(jié)核菌培養(yǎng)陽性；病理檢查證實有結(jié)核病變；膀胱鏡及(或)X線尿路造影有結(jié)核病的典型表現(xiàn)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室各種檢查結(jié)果作出診斷。非泌尿系結(jié)核患者診斷依據(jù)：臨床已確診為其他部位結(jié)核患者(包括肺結(jié)核，腸結(jié)核，子宮內(nèi)膜結(jié)核，結(jié)核性胸膜炎，結(jié)核性腦膜炎，血行播散性結(jié)核)及泌尿系感染，泌尿系腫瘤患者。

1.2 主要試劑和儀器 抗酸染色試劑為實驗室自配萋尼染色試劑；MGIT 960檢測系統(tǒng)所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國BD公司提供；GeneXpert檢測系統(tǒng)及配套試劑盒均購于美國Cepheid公司。

1.3 檢測方法 按照無菌采集標本的要求收集留取患者晨尿標本至少5 ml，每份標本均進行AFB涂片，MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測。①AFB涂片：嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[8]操作。將尿液標本用一次性吸管吸取少許于潔凈玻片上涂片，大小約為1 cm×2 cm、干燥后萋尼染色鏡檢，按照檢驗規(guī)程報告結(jié)果。②MGIT 960培養(yǎng)：嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[9]操作。取2 ml尿液標本經(jīng)N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法(NALC-NaOH，終濃度為1.5%)消化去污處理后，室溫靜置15 min，用磷酸鹽緩沖液(pH=6.8PBS)中和后再3000 g離心15 min，棄上清，2 ml PBS緩沖液重懸沉淀物，取0.5 ml重懸液接種至MGIT 960培養(yǎng)管中，加入0.8 ml 營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴格按照說明進行操作。將接種好的MGIT960培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)中孵育，儀器對分枝桿菌的生長進行自動監(jiān)測。儀器報陽后采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒(MPB64)進行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[10]。③GeneXpert檢測：嚴格按照操作說明書進行檢驗。將1 ml尿液標本與2 ml GeneXpert 系統(tǒng)前處理液混合，擰緊瓶蓋，渦旋震蕩15 s，室溫靜置15 min，使標本充分液化，將消化后的2 ml樣品用無菌吸管吸入GeneXpert系統(tǒng)測試盒中，上機檢測，約2 h報告結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。以臨床確診患者為參考標準，評價AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert及MGIT960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測技術(shù)的敏感度、特異度、符合率、陽性預測值和陰性預測值。組間率的比較采用χ2檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 112例患者一般資料 112例患者中男 59例、女 53例，其中62例(55.4%)確診為泌尿系結(jié)核患者(UTB組),18例(29.0%)尿結(jié)核菌培養(yǎng)陽性；44例(71.0%)以膀胱鏡及(或)X線尿路造影有結(jié)核病的典型表現(xiàn)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室各種檢查結(jié)果作出診斷。50例(44.6%)臨床確診為非泌尿系結(jié)核(非UTB組)患者(包括肺結(jié)核25例，腸結(jié)核4例，子宮內(nèi)膜結(jié)核2例，結(jié)核性胸膜炎4例，結(jié)核性腦膜炎3例，血行播散性結(jié)核2例及泌尿系感染6例，泌尿系腫瘤4例)。UTB組中男34例(54.8%)、女28例(45.2%)；年齡17～73歲，平均(46.37±15.51)歲；非UTB組中男25例(50.0%)、女25例(50.0%)，年齡19～78歲，平均(45.42±18.13)歲。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 不同檢測方法診斷UTB的效能 以臨床確診泌尿系結(jié)核患者為標準，AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert對UTB的檢測效能，見表2。AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測的敏感度分別為12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%),29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%),53.2%(33/62,95%CI：40.8%～65.6%)和72.6%(45/62，95%CI：61.5%～83.7%)。尿液標本AFB涂片的敏感度低于MGIT 960培養(yǎng)(χ2=4.87,P<0.05),尿液標本AFB涂片的敏感度低于GeneXpert檢測(χ2=22.77,P<0.05),62例臨床診斷患者中MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測UTB結(jié)果有6例患者結(jié)果是一致的， MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測的敏感度高于GeneXpert檢測(χ2=4.97,P<0.05)、MGIT 960培養(yǎng)(χ2= 23.52,P<0.05)以及AFB涂片(χ2=45.11,P<0.05)。特異度分別為96.0%(48/50),100.0%(50/50)，100.0%(50/50)和100.0%(50/50)；符合率分別為50.0%(56/112),60.7%(68/112)，74.1%(83/112)和84.8%(95/112)。

表2 不同檢測方法對UTB診斷效能

3 討 論

UTB是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性、進行性、破壞性病變，是肺外結(jié)核的一種，泌尿系結(jié)核病中以腎結(jié)核最為重要，常常在肺結(jié)核病發(fā)生或愈合較長時間以后才開始出現(xiàn)臨床病象，多繼發(fā)于肺結(jié)核[11-14]。由于UTB早期臨床癥狀不明顯和缺乏特異性常常導致診斷的延誤，從而影響患者的生存質(zhì)量并危及生命。傳統(tǒng)的細菌學檢測方法仍是結(jié)核病診斷的“金標準”，然而與痰標本不同，尿液標本實驗室檢查中AFB涂片查找抗酸桿菌的陽性率很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長、不能滿足臨床早期、快速、準確診治的需求，故尋求一種新的快速、準確且高敏感度和高特異度的診斷方法成為UTB檢測工作的重要目標[15-16]。而GeneXpert檢測作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價值已被多項研究評估[17-18]，認為應用GeneXpert檢測胸腔積液、腦脊液及骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標本具有較高的敏感度和檢測方法的優(yōu)越性，被認為可用于肺外結(jié)核的各種類型的臨床標本(如腦脊液和組織樣本)檢測的確證性診斷試驗，但對于尿液的檢測效果數(shù)據(jù)較少，2017年P(guān)ang等[19]以L-J固體培養(yǎng)法為診斷標準比較了AFB涂片、L-J固體培養(yǎng)法和GeneXpert三種檢測方法在UTB中的診斷敏感度，分別為18.5%(15/81，95%CI：10.1%～20.7%)，45.7%(37/81，95%CI：34.8%～56.5%)和63.0%(51/81，95%CI：52.4%～73.5%)。陳禹等[20]以臨床確診為診斷金標準比較了AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert三種檢測方法在UTB中的診斷敏感度，分別為11.9%(7/59，95%CI：4.9%～22.9%)，42.4%(25/59，95%CI：29.6%～55.9%)和為64.4% (38/59，95%CI：50.9%～76.4%)。本研究中以臨床確診為診斷標準比較了AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert三種檢測方法在UTB中的診斷敏感度，分別為12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%)，29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%)和53.2% (33/62，95%CI：40.8%～65.6%)。相比于其他研究本研究這三種檢測方法的敏感度均較低，尤其以MGIT 960培養(yǎng)更為明顯，分析原因主要有以下幾點：①尿液標本含菌量本身就較低，而此次納入的臨床患者留取的尿液標本均為晨尿，并非24 h尿，含菌量更少使得陽性檢出率更低；②此研究中AFB涂片法的尿液標本染色具體實驗操作方法同痰液，冷染半個小時，而尿液標本的相比較痰液黏附率本身就很低[21]，冷染時間長固定效果減弱沖片時更容易脫落，且AFB涂片需抗酸桿菌達到5×103～1×104個/ml的濃度才能檢測出陽性結(jié)果，涂片樣本量難以達到檢測需求故而陽性檢出率更低；③MGIT 960培養(yǎng)對環(huán)境要求極高，但前處理過程較為復雜，尿液標本在處理過程中所用的消化條件與痰液相同，而該處理過程更適合痰液，對于含菌量較少的尿液標本來說過于嚴苛，使得尿液樣本中的大多結(jié)核分枝桿菌暴露于堿性環(huán)境中[22]，從而使一定比例的結(jié)核分枝桿菌被殺死失去活性，且最終培養(yǎng)的加樣量僅有500 μl載菌量較低，從而導致MGIT 960培養(yǎng)陽性檢出率低；④GeneXpert雖操作過程簡單，但加樣量也只有1 ml，載菌量也較低；⑤有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在感染患者的尿液中間歇排泄，單個尿液標本(如晨尿、隨機尿)比24 h尿標本更可能呈現(xiàn)假陰性[23]，這也是此次研究這幾種檢測方法敏感性均較低的主要原因。

本研究中，AFB涂片法的敏感度最低，其中有2例涂片陽性的疑似患者臨床最終確診為非泌尿系結(jié)核。GeneXpert檢測的敏感度明顯高于其他兩種檢測方法，但MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert的檢測陽性者僅有6例為同時陽性，重疊比例較低，這可能的原因為：本研究中大多UTB患者在留取樣本之前已經(jīng)在當?shù)亟Y(jié)核病院進行了一段時間的抗結(jié)核藥物治療，而結(jié)核菌培養(yǎng)主要針對檢測的是活的結(jié)核分枝桿菌，GeneXpert主要檢測的是結(jié)核分枝桿菌的DNA，已使用抗結(jié)核藥物將會影響結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)陽性檢出率，且MGIT 960培養(yǎng)與GeneXpert的細菌濃度陽性閾值檢測限也不相同(前者為100條/ml，后者為131條/ml)。在這三種檢測方法中GeneXpert檢測有明顯的優(yōu)點：用時短、2 h可在患者標本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌，且能檢測利福平是否耐藥，但是盡管現(xiàn)代分子生物學技術(shù)在結(jié)核病研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，但是結(jié)核桿菌培養(yǎng)方面依然有著不可替代的作用，而且至今仍然是結(jié)核及肺外結(jié)核診斷的金標準[24]，較AFB涂片的敏感性要高，對于排菌量小、涂片檢測陰性的患者能及時發(fā)現(xiàn)傳染源，對疫情控制有重要價值，在結(jié)核病的診斷、菌種鑒定、藥物敏感性試驗為了更好的為臨床提供診斷依據(jù)，所以為了提高陽性檢出率，避免漏檢，更好的利用每種檢測方法的優(yōu)點。本研究采用MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測，得出其敏感度為72.6%(45/62，95%CI：61.5%～83.7%)遠遠高于GeneXpert檢測、MGIT 960培養(yǎng)和AFB涂片三種檢測方法在UTB中的診斷敏感度：53.2% (33/62，95%CI：40.8%～65.6%)(χ2=4.97，P<0.05)；29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%)(χ2= 23.52，P<0.05)；12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%)(χ2=45.11，P<0.05)。所以MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測在UTB中有較高的診斷優(yōu)勢，可以進一步推廣。

本研究也存在一定的局限性：①雖然統(tǒng)計了全年疑似病例，但是最終納入的UTB患者樣本量仍然較小；②本研究中MGIT 960培養(yǎng)對尿液標本前處理使用的是痰液的處理方式，降低了MGIT 960培養(yǎng)對尿液標本中結(jié)核分枝桿菌的檢出率；③由于實驗室檢測條件有限，對于不相符的檢測結(jié)果未能進行進一步研究?；诖舜蔚难芯拷Y(jié)果， MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測在尿液樣本中檢測結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)異性還需要更大的樣本量來驗證，并對于不相符的結(jié)果最好能夠進行基因測序等進一步驗證。

綜上所述，GeneXpert檢測對UTB早期診斷具有較高的敏感度和特異度且高于傳統(tǒng)的抗酸染色涂片鏡檢和結(jié)核菌培養(yǎng)，但因其檢測量只有1 ml，可能導致結(jié)核分枝桿菌載菌量較低而使檢測敏感度較低，另外為了鑒定結(jié)核分枝桿菌并對抗結(jié)核藥物進行藥物敏感性試驗，僅僅依靠PCR方法是不夠的。而MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測，不僅結(jié)合了MGIT 960培養(yǎng)檢出活的結(jié)核分枝桿菌以及GeneXpert早期快速的優(yōu)勢，更好的發(fā)現(xiàn)傳染源并進行菌種鑒定，也補充了GeneXpert檢測技術(shù)在耐藥檢測方面的單一性，能更好的指導臨床用藥及合理調(diào)整用藥方案，對患者的診斷治療以及耐藥篩查都有很大的幫助，也大大降低了漏診率，篩查意義更重大。