陳 隆，張玉富

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710038)

膠質瘤是世界范圍內常見的顱內惡性腫瘤，每年40多萬人因患膠質瘤而死亡[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)將膠質瘤分為低級別(WHO I級和Ⅱ級)和高級別(WHO Ⅲ級和IV級)。雖然膠質瘤患者可以通過手術切除聯(lián)合術后放化療治療，但患者存活率相當?shù)?。有研究[1-2]表明膠質瘤患者的5年生存率不到15%，中位生存期只有12～18個月。近年來，研究人員開始關注膠質瘤的分子機制、預后及生物標志物治療，試圖開發(fā)針對膠質瘤患者的分子靶向治療，以控制膠質瘤的進程[3-4]。環(huán)狀RNA(Circular RNA)是一種特殊類型的非編碼RNA，由內源性RNA共價結合形成閉合環(huán)，其沒有5’端帽子和3’端PolyA尾巴，主要分布在細胞質中。環(huán)狀RNA于20世紀70年代于病毒中首次被發(fā)現(xiàn)，最初被認為是一種錯誤的剪切產物[5]。但近年來，高通量測序和生物醫(yī)學研究證實了許多環(huán)狀RNA為組織特異性表達，且在各種生理病理過程中起重要的調節(jié)作用。更有越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA在膠質瘤中差異表達，調節(jié)膠質瘤的發(fā)生、增殖和侵襲，因此可能成為膠質瘤診斷的潛在標記物[2]。此外，一些環(huán)狀RNA與膠質瘤分期有關，可能有助于判斷患者的預后[6]。有文獻[7]報道，Circular RNA PRKCI通過競爭性抑制microRNA-545的作用，從而促進膠質瘤的增殖和侵襲。鑒于此，本研究旨在探討Circular RNA PRKCI在腦膠質瘤中的表達及其預后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經病理確診的61份膠質瘤標本取自從2012年5月至2015年1月開始在空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經外科接受手術的患者，年齡25～78歲，其中男性37例，女性24例，WHO Ⅰ級12例，WHO Ⅱ級15例，WHO Ⅲ級16例，WHO Ⅳ級18例。另有35例正常腦組織標本取自本科顱腦損傷患者，其中男性21例、女性14例，年齡21～63歲，術前影像學及病史詢問均無膠質瘤病史，患者均行開顱手術清除受傷病灶，其組織作為本研究的對照組。術前患者均未接受放化療，也排除患者有其他重大疾病及未同意參與實驗者。所得標本保存于液氮中。本研究獲得了唐都醫(yī)院倫理委員會書面同意及批準，實驗過程嚴格按照指導方針執(zhí)行。

1.2 研究方法 對照組組織和膠質瘤標本用Fast Start Universal SYBR Green Master(德國羅氏)對總RNA進行cDNA和RT-qPCR檢測，選擇GAPDH作為內源性對照。聚合酶鏈式反應RNA樣品用TRIzol試劑提取。分光光度計檢測A260/280和A260/230處的光密度值，評價提取RNA的濃度和純度。將RNA反轉錄為cDNA，再用qRT-PCR進行擴增，檢測相關基因的表達。實驗所用到的相關引物：Circular RNA PRKCI正向：5’-ATTCAGGGACACCCGTTC-TT-3’和反向：5’-CTCTTCAGAACACTTGCAGCT-T-3’，GAPDH正向：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，反向：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’)。

2 結 果

2.1 Circular RNA PRKCI在膠質瘤組和對照組中的表達 見表1。結果顯示，與對照組相比，Circular RNA PRKCI在Ⅰ-Ⅱ級的膠質瘤組織中顯著降低[(1.000±0.2287)與(2.707±0.1979),P<0.001]，且Ⅲ-Ⅳ級膠質瘤組織中的表達較Ⅰ-Ⅱ級低[(2.707±0.1979)與(3.830±0.2169),P=0.0019]。

表1 Circular RNA PRKCI在對照組和膠質瘤組織中的表達

2.2 Circular RNA PRKCI水平與膠質瘤患者臨床病理特征的關系 見表2。根據Circular RNA PRKCI表達均值，將61例膠質瘤患者分為低表達組(28例)和高表達組(33例)。Circular RNA PRKCI的表達水平與WHO分級、KPS評分顯著相關，此外，Circular RNA PRKCI的表達與年齡、性別、腫瘤大小、癌癥家族史無明顯相關性。

表2 Circular RNA PRKCI表達與膠質瘤患者臨床病理指標的關系(例)

2.3 Circular RNA PRKCI表達水平與患者預后的關系 Kaplan-Meier分析和對數(shù)秩檢驗顯示，Circular RNA PRKCI高表達患者的5年存活率比低表達Circular RNA PRKCI的患者差，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0309),見圖1。進一步評估Circular RNA PRKCI的預后作用，COX分析Circular RNA PRKCI和其他臨床參數(shù)對患者預后的影響，結果表明，WHO分級、KPS評分、Circular RNA PRKCI表達水平與患者預后有關，且Circular RNA PRKCI過度表達(P<0.001)可作為膠質瘤患者的預后的獨立預測因子,見表3。

圖1 Circular RNA PRKCI高表達和低表達患者生存時間比較

表3 膠質瘤患者各項臨床病理指標的單因素和多因素分析

3 討 論

膠質瘤是一種嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤，主要影響腦內的膠質細胞，而膠質細胞在神經元的相互作用中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用，加上膠質瘤的侵襲性生長，很難通過外科手術完全切除腫瘤[8-10]。因此，盡管在神經腫瘤的診療方面取得了長足的進步，但膠質瘤患者的存活率仍然很低，據報道低WHO分級膠質瘤患者的平均生存時間約為60個月，而高WHO分級膠質瘤患者的平均生存時間僅有13個月[11-13]。

環(huán)狀RNA早在20世紀70年代在病毒中被發(fā)現(xiàn)，后又于多種生物體內檢測到環(huán)狀RNA的存在，但其一直被認為是錯誤的剪接產物，在體內無實際功能[14-15]。而新近研究表明，環(huán)狀RNA可參與調節(jié)轉錄、轉錄后、表觀遺傳等基因表達網絡[16]。CircRNA在多種疾病尤其是腫瘤中均有不同程度的表達，可作為新的診斷和預后的生物標志物，且與其他RNA相比，環(huán)狀RNA干預具有較少的脫靶和副作用。因此，環(huán)狀RNA是更有前景的分子治療靶點[17]。我們所研究的Circular RNA PRKCI分子此前已被證實在多種腫瘤中具有促癌作用，其在食管癌中的表達水平高于正常對照，且通過miR-3680-3p作為內源競爭RNA調節(jié)AKT3的表達，這可能在食管癌的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[18]。環(huán)狀Circular RNA PRKCI通過與在胃癌組織和細胞系中錯誤地高表達，并通過結合microRNA-545，促進胃癌細胞增殖和侵襲[19]。此外，Circular RNA PRKCI還通過與microRNA-1324結合促進MECP2的表達從而促進肺癌進展，提示我們Circular RNA PRKCI可能成為治療肺癌的潛在靶點[20]。

我們的研究證實了Circular RNA PRKCI在膠質瘤中高表達，與此同時，數(shù)據分析表明高WHO分級的膠質瘤患者具有更高水平的Circular RNA PRKCI，提示Circular RNA PRKCI可與膠質瘤的惡性程度有一定關系。隨后我們分析了Circular RNA PRKCI水平與臨床病理特征的各項指標，得到Circular RNA PRKCI的表達與WHO分級、KPS評分、顯著相關，與年齡、性別、腫瘤大小、癌癥家族史無明顯關系的結果。我們進一步探討了患者預后與Circular RNA PRKCI有無聯(lián)系，根據統(tǒng)計結果，我們發(fā)現(xiàn)Circular RNA PRKCI的高表達與患者5年生存率低下有關，單因素和多因素分析顯示高表達的Circular RNA PRKCI的表達水平與高WHO分級、低KPS評分是影響預后的獨立危險因素。這些結果可能為Circular RNA PRKCI導向診斷和治療腦膠質瘤的研究提供新的視角和方向。

綜上，Circular RNA PRKCI在膠質瘤組織中高表達，且其過表達可能導致了患者的不良預后。對Circular RNA PRKCI的進一步研究對今后膠質瘤等疾病的診斷和治療具有重要的臨床意義。