金秀琳，詹俊杰，范宗憲

(佳木斯大學(xué)附屬第一院耳鼻喉科，黑龍江 佳木斯 154003)

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科多發(fā)病之一，其分子發(fā)病機(jī)制的研究目前還有待深入，喉癌患者的早期診斷對(duì)精準(zhǔn)特異化治療至關(guān)重要，因此急需探明喉癌基因源性發(fā)病機(jī)制。微小RNA (microRNA, miRNA)是由小于30個(gè)核苷酸序列組成的不直接翻譯蛋白產(chǎn)物的小RNA，參與細(xì)胞新陳代謝、復(fù)制增殖及自噬凋亡等重要生命過(guò)程[1,2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)miR-509-3p為調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因子。本研究運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)miR-509-3p和預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因Rab11a在喉癌及癌旁組織中的表達(dá)量；再行miR-509-3p mimics轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，檢測(cè)Rab11a的表達(dá)量，分析miR-509-3p和Rab11a的相關(guān)性。為尋求喉癌的分子發(fā)病機(jī)制提供一定的參考依據(jù)。通過(guò)對(duì)miR-509-3p在喉癌中的重要作用，將為今后喉癌miRNAs的診斷治療提供新視點(diǎn)。

1 材料與方法

選取2019-01～2019-10于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科治療的術(shù)中新鮮標(biāo)本15例，均為初次患病，術(shù)前未經(jīng)放療及化療且病理報(bào)告為喉部鱗狀細(xì)胞癌。癌標(biāo)本切取腫瘤主體，避開(kāi)壞死區(qū)域；癌旁正常標(biāo)本取距腫瘤安全緣0.5cm以上的組織。標(biāo)本離體清潔后，半小時(shí)內(nèi)置于無(wú)RNA酶的專(zhuān)用凍存管液氮罐中速凍。15例喉癌患者中，男12例，女3例，年齡52～76歲，平均62.4歲。其中TNM分期依照UICC2002第6版喉癌分期標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中II期3例，III期9例，Ⅳ型3例。組織學(xué)類(lèi)型依照1990年WHO喉癌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[4]分類(lèi)，其中高分化型5例，中分化型8例，低分化型2例。

1.1 試劑與儀器

Trizol RNA提取液(天根)，PerfectStart Green qPCR SuperMix(AQ601-04全式金)，oligdT(擎科)，RNase inhibitor(E00381 Thermo)，RevertAid Reverse Transcriptase(EP0441 Thermo)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Q1 ABI)，超微量核酸分析儀(Nano-200 杭州奧盛儀器有限公司)，冷凍離心機(jī)(H2100R 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)等。

1.2 提取總RNA

將TRizoI抽提液與組織標(biāo)本或細(xì)胞混勻，加氯仿震蕩，離心，上清液加異丙醇后靜置數(shù)小時(shí)，離心取沉淀物，待部分溶解后加DEPC水，完全溶解后于超微量核酸分析儀下測(cè)提取RNA的純度及濃度(A260/280比值在1.8～2.1時(shí)，提示滿(mǎn)意)，瓊脂凝膠電泳測(cè)總RNA的完整度情況。檢測(cè)合格后將總RNA置于-80 ℃冰箱凍存。見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染miR-509-3p-mimics后總RNA純度及濃度檢測(cè)

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)方法

取總RNA為初始模板，在特異引物和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成與待測(cè)模板互補(bǔ)的DNA，產(chǎn)物為模板RNA-cDNA雙鏈結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中模板RNA被RNA酶H降解，僅留新合成的cDNA作為PCR放應(yīng)的初始模板進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)PCR放應(yīng)體系中熒光基團(tuán)發(fā)光程度計(jì)算2-△△Ct值，評(píng)估初始RNA模板的相對(duì)表達(dá)量。

引物設(shè)計(jì)如下： miR-509-3p-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-CAGTTGAGCTACCC；miR-509-3p-F：GCCGAGTGATTGGTACGTCT；has-Rab11a-175-F：AGAAGCATCCAGGTTGATGG；has-Rab11a-175-R：GTTCTTTCAGCCATCGCTCT。GAPDH-127F(H)：CCAGGTGGTCTCCTCTGA；GAPDH-127R(H)：GCTGTAGCCAAATCGTTGT。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將Hep-2細(xì)胞快速融化，離心后置于10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中37℃ 5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，平鋪細(xì)胞幾近接觸時(shí)進(jìn)行傳代。

轉(zhuǎn)染：將培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，完全培養(yǎng)基終止消化，按照Hep-2細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔接種到24孔板中，平鋪細(xì)胞后培養(yǎng)18～24h，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80%后，給予轉(zhuǎn)染。RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)同前。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS statistics 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于兩組以上數(shù)據(jù)之間的比較，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，皮爾遜相關(guān)性分析 miR-509-3p與Rab11a相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)15例喉癌組織中miR-509-3p平均表達(dá)量低于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1A；Rab11a平均表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1B；皮爾遜相關(guān)分析呈負(fù)相關(guān)(r<0)。

A B

2.2 miR-509-3p mimic轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞株后預(yù)測(cè)目的基因Rab11a表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)結(jié)果揭示轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic組預(yù)測(cè)靶基因Rab11a表達(dá)水平較NC轉(zhuǎn)染組和空白組下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。Rablla表達(dá)圖 RT-9PCT擴(kuò)增曲線及熔解曲線，見(jiàn)圖3。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-509-3p-mimics后Rab11a表達(dá)量

A B

3 討論

喉癌患病率排名僅次于鼻咽癌，大多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌，僅5%左右為其他類(lèi)型細(xì)胞癌，占全身惡性腫瘤的3%左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)每十萬(wàn)人就有一人患有喉癌，東北、華北的發(fā)病率較高。為減少喉癌的患病率及有效的靶向治療，急需尋求喉癌發(fā)病的分子機(jī)制。miRNA能夠特異性結(jié)合在目標(biāo)信使RNA ( mRNA)的3' 非翻譯區(qū)，當(dāng)堿基配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接將目標(biāo)mRNA切割降解；如堿基對(duì)只部分配對(duì)結(jié)合，則制止mRNA蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)[5]。新研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還可結(jié)合到目的mRNA 5'非翻譯區(qū)[6]和基因表達(dá)區(qū)[7]，從而對(duì)蛋白翻譯過(guò)程進(jìn)行修飾。

miRNA-509-3p已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子。miRNA-509-3p在胃癌組織[8]、腎癌組織[9]及卵巢上皮癌組織[10,11]中表達(dá)均下調(diào)。而且過(guò)表達(dá)miRNA-509-3p抑制胃癌細(xì)胞的存活能力，提高遠(yuǎn)期生存率，還可以誘導(dǎo)了腎癌細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)提高卵巢癌上皮細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

Rab11a在膜受體介導(dǎo)的胞吞大分子物質(zhì)中發(fā)揮著重要的作用。高表達(dá)Rab11a后：通過(guò)TBC[12]結(jié)構(gòu)域抑制細(xì)胞自噬行為；抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良；還可提高胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，通過(guò)磷酸化GSK3β激活Wnt信號(hào)通路[13]促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1、E的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[14]。

為了明確miRNA-509-3p和 Rab11a在喉癌中表達(dá)量及相關(guān)性，探索其可能致病機(jī)理。本課題分為2部分進(jìn)行研究：首先運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)miR-509-3p和Rab11a在15例喉癌及癌旁組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-509-3p平均表達(dá)量低于癌旁組織，Rab11a平均表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.05)；皮爾遜相關(guān)分析呈負(fù)相關(guān)(r<0)。再行miR-509-3p mimics轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic組Rab11a表達(dá)水平較NC轉(zhuǎn)染組和空白組下調(diào)(P<0.05)。分析Rab11a的致癌原因可能通過(guò)磷酸化GSK3β激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1、E的表達(dá)，提高喉癌細(xì)胞的增殖能力；增強(qiáng)喉癌細(xì)胞對(duì)大分子物質(zhì)的攝取，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持；再之通過(guò)TBC結(jié)構(gòu)域抑制癌細(xì)胞自噬行為，為喉癌細(xì)胞的生存提供完整的基本結(jié)構(gòu)和保障。本研究證實(shí)miR-509-3p至少可通過(guò)負(fù)向調(diào)控Rab11a的表達(dá)而發(fā)揮其抑癌作用，為進(jìn)一步證實(shí)Rab11a是miR-509-3p的靶基因奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。如確定Rab11a是miR-509-3p的靶基因還需做雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)；對(duì)于miR-509-3p和Rab11a對(duì)喉癌細(xì)胞遷移能力的影響及是否抑制喉癌細(xì)胞凋亡等方面還有待繼續(xù)研究。