戰(zhàn)翔宇，孫玉鴻，陳 瑞，趙 陽，張東瑞，薛 嵩，劉 佳，隋洪玉

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最嚴(yán)重和常見的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者的主要死因之一[1]，其早期病理改變主要為腎臟肥大。腎臟肥大是由于細(xì)胞的肥大和增生聯(lián)合所致，其機(jī)制涉及許多因素，諸如血流動(dòng)力學(xué)、高血糖、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、代謝因素及某些特異基因表達(dá)等，其中細(xì)胞因子起著非常重要的作用[2,3]。研究顯示，TNF-α與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]，但它是否參與了DN中腎臟肥大的形成過程鮮有報(bào)道。本研究旨在探討TNF-α對糖尿病腎病大鼠腎臟肥大的影響，以期為糖尿病腎病的早期防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD (Sprague- Dawley)大鼠，體質(zhì)量180～220g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)由Sigma公司提供，TNF-α抗體由Abcam公司提供，Actin-β由Affinity公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

取32只SD雄性大鼠(200～250g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食10h后，隨機(jī)平均分成4組，分別為：正常組(NC，n=8)、糖尿病模型組(DM，n=8)、正常+TNF-α阻斷劑組(NC+TNFR:Fc，n=8)、糖尿病+TNF-α阻斷劑組(DM+TNFR:Fc，n=8)。DM組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)造模；NC組腹腔注射與DM組等量的檸檬酸緩沖液作為對照；NC+TNFR:Fc組腹腔注射與DM組等量的檸檬酸緩沖液，并在注射前一天皮下注射TNFR:Fc(2mg/kg)，以后按周2次注射TNFR:Fc至3周；DM+TNFR:Fc組腹腔注射STZ，并在注射STZ前一天皮下注射TNFR:Fc(2mg/kg)，以后按周2次注射TNFR:Fc至3周。

1.3.2 Western blot技術(shù)

取50μg蛋白樣品上樣后進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(200mA, 1h)，5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1h后進(jìn)行一抗孵育并4℃過夜，TBST溶液洗膜(4×10min)，室溫下二抗孵育1h，TBST溶液洗膜(4×10min)，ECL發(fā)光液顯影后進(jìn)行凝膠成像分析。

1.3.3 ELISA技術(shù)

加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品及檢測樣本至反應(yīng)孔中，再加入50μL的相應(yīng)抗體至所有孔，封板后室溫下孵育1h，洗液洗板3次后加入100μL 顯色底物至所有反應(yīng)孔中并孵育10min，加入100μL停止液后立即用酶標(biāo)儀450nm波長下測量OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖及24 h尿白蛋白變化

在實(shí)驗(yàn)72h和3周時(shí)檢測大鼠空腹血糖，3周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測24h尿白蛋白排泄量。結(jié)果顯示：與NC組相比，DM組空腹血糖明顯升高(P<0.01)；與NC組相比，DM組24 h尿白蛋白排泄量明顯升高(P<0.01)。結(jié)果表明糖尿病腎病模型制備成功。見表1。

表1 大鼠空腹血糖及24h尿白蛋白變化

2.2 腎組織中TNF-α蛋白表達(dá)變化

應(yīng)用Western blot法檢測腎組織中TNF-α的蛋白表達(dá),見圖1。結(jié)果顯示：與NC組相比，DM組腎組織中TNF-α的蛋白表達(dá)明顯升高(n=3,P<0.01)。

圖1 大鼠腎組織中TNF-α的蛋白表達(dá)

2.3 TNF-α對糖尿病大鼠腎臟肥大的影響

3周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，立即取出大鼠雙側(cè)腎臟并稱重，通過腎濕重/體重計(jì)算腎指數(shù)。結(jié)果顯示：與NC組相比，DM組腎指數(shù)明顯升高(n=8,P<0.01)；與DM組相比，DM+TNFR:Fc組腎指數(shù)下降(P<0.05)。見表2。

表2 TNF-α對糖尿病大鼠腎指數(shù)的影響

3 討論

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，已成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年全球約有4.63億糖尿病患者，中國糖尿病患者約為1.164億，位居世界首位，國際糖尿病聯(lián)合會預(yù)測2035年全球糖尿病患者人數(shù)將增至5.52億，這意味著每年將近增加一千萬新糖尿病患者。糖尿病引起的各種急慢性并發(fā)癥，致殘、致死率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及壽命，造成巨大的家庭和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，亦是誘發(fā)終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)最常見的原因，其已成為不可忽視的社會經(jīng)濟(jì)問題[5]。

目前普遍認(rèn)為DN是一種具有慢性、輕微等特征的“微炎癥”疾病[6,7]，主要表現(xiàn)為以巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞的激活以及各種與炎癥相關(guān)的炎性細(xì)胞因子在患者腎組織中的聚集。研究顯示，高血糖、脂質(zhì)代謝異常及腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變等均可刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重腎臟組織損傷，促進(jìn)DN的發(fā)生與發(fā)展[8,9]。腫瘤壞死因子是一種具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α及TNF-β兩類。TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，也可由中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生。在腎臟，TNF-α主要是由系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等產(chǎn)生。TNF-α與眾多炎性因子共同參與到DN形成的病理過程中，在DN的發(fā)病機(jī)制中擔(dān)當(dāng)重要角色。TNF-α可直接對腎臟細(xì)胞造成細(xì)胞毒性，誘發(fā)腎損傷、凋亡和細(xì)胞壞死等；TNF-α可提高系膜細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白的分泌、聚集，刺激腎小球細(xì)胞增殖；還可誘導(dǎo)腎臟系膜細(xì)胞產(chǎn)ROS，改變腎小球血管壁的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，增加濾過膜的通透性，產(chǎn)生蛋白尿，但是否參與到DN腎臟肥大的形成中尚未明確。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot等技術(shù)觀察了糖尿病腎病大鼠模型腎組織中TNF-α的蛋白表達(dá)，以及TNF-α對腎指數(shù)的影響，結(jié)果顯示，DN大鼠腎組織TNF-α蛋白水平及腎指數(shù)顯著上升，而給予其阻斷劑后腎指數(shù)下降，說明TNF-α促進(jìn)了糖尿病大鼠腎臟肥大的形成，但其形成機(jī)制尚需探討，在以后的實(shí)驗(yàn)研究中將進(jìn)一步尋找TNF-α促進(jìn)腎臟肥大是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探明TNF-α對糖尿病性腎臟肥大形成機(jī)制積累了一定的理論依據(jù)，亦為DN的靶向治療提供了新的作用靶點(diǎn)。