楊柳青 陳菁雙 章勤

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院 杭州 310007

過去的幾十年中，卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）發(fā)病率從19%上升到26%，是導(dǎo)致不孕和輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）失敗的主要原因[1]。高齡是導(dǎo)致DOR的主要因素，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、職業(yè)壓力的增大，高齡妊娠已成全球普遍現(xiàn)象[2-3]。高齡DOR患者，在體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）中不僅面臨獲卵數(shù)少、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)少、低活產(chǎn)率等問題，同時(shí)存在胚胎質(zhì)量差、胚胎非整倍體率升高等風(fēng)險(xiǎn)[4]。卵子以及受精后胚胎的數(shù)量和質(zhì)量是IVF最重要的預(yù)后影響因素，因此改善高齡DOR患者卵巢生殖和內(nèi)分泌功能，獲得適量、高質(zhì)量的卵子是IVF-ET成功的關(guān)鍵，也是突破IVF-ET低妊娠率和低活產(chǎn)率瓶頸的關(guān)鍵所在。

目前，DOR的西醫(yī)治療包括脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、雌激素、生長激素等，但效果欠理想[5-6]。近年來，有研究者提出卵母細(xì)胞線粒體補(bǔ)充和間充質(zhì)干細(xì)胞有望治療DOR，但目前僅限于動物模型研究，很少有臨床報(bào)道，缺乏系統(tǒng)的臨床研究，因而無法提供足夠大的樣本來證實(shí)治療的安全性和有效性[7-8]。

何氏養(yǎng)巢方源于何氏婦科祖?zhèn)鹘?jīng)驗(yàn)方育麟方，是何氏婦科五代名中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，多年臨床應(yīng)用及研究表明其具有改善卵巢功能和助孕的作用[9-12]。本研究通過觀察入組患者激素水平、獲卵數(shù)、早期胚胎體外發(fā)育等情況，就何氏養(yǎng)巢方對高齡DOR患者的卵巢功能及IVF中的作用開展進(jìn)一步的臨床研究。

1 對象和方法

1.1 患者來源 選擇2019年1月至2020年8月于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院中醫(yī)婦科門診就診，擬于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院生殖中心行IVF的患者。本研究已通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（倫理審批號：2019SQ033）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2015年美國生殖醫(yī)學(xué)會（American Society of Reproductive Medicine）頒布的《卵巢功能檢測及其含義解釋的專家共識》[13]和第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》，并結(jié)合2011年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）頒布的博洛尼亞共識制定本臨床研究高齡DOR的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：（1）年齡≥35歲；（2）竇卵泡計(jì)數(shù)（antral follicle count，AFC）＜5～7個(gè)；（3）抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）＜0.5～1.1ng·mL-1（＜3.6～7.9nmol·L-1）；（4）基礎(chǔ)促卵泡生成素/黃體生成素 （follicle stimulating hormone/luteinizing hormone，F(xiàn)SH/LH）值＜3。 具備（1）以及（2）～（4）中的任意1項(xiàng)。

1.2.2 中醫(yī)腎虛證辨證標(biāo)準(zhǔn) 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[15]和張玉珍[16]主編的《中醫(yī)婦科學(xué)》，擬定腎虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)：（1）腰膝酸軟；（2）性欲減退；（3）畏寒肢冷；（4）夜尿頻多；（5）口干咽燥；（6）頭暈耳鳴；（7）潮熱盜汗；（8）陰中干澀；（9）舌脈：舌淡或紅，脈沉或細(xì)數(shù)。 （1）～（8）具備≥3項(xiàng)，結(jié)合舌脈即可做出診斷。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合高齡DOR及中醫(yī)腎虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）有規(guī)律的自發(fā)性月經(jīng)周期，為21～35d；（3）治療前3個(gè)月未使用過激素類藥物，包括性激素及糖皮質(zhì)激素類；（4）采用高孕激素狀態(tài)下促排卵方案（progestin primed ovarian stimulation，PPOS） 方案促排；（5）愿意遵守、配合診療方案，并簽署知情同意書。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＞35kg·m-2的女性；（2）參照《人類輔助生殖技術(shù)配置規(guī)劃指導(dǎo)原則（2015版）》[17]，不符合IVF-ET入選標(biāo)準(zhǔn)；（3）入組前接受輔助生殖的控制性促排卵周期（controlled ovarian stimulation，COS）＞3次；（4）合并糖尿病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、甲狀腺疾病、高泌乳素血癥等內(nèi)分泌疾病者和精神病者；（5）已知對中藥及DHEA過敏者；（6）配偶因素導(dǎo)致的不孕，如：重度少弱精。

1.2.5 剔除、脫落標(biāo)準(zhǔn) （1）依從性差，不遵守約定的治療方案者；（2）失訪者；（3）中途改變促排方案者；（4）用藥過程中發(fā)生不良反應(yīng)，需進(jìn)一步處理，不宜繼續(xù)當(dāng)前治療方案者。用藥過程中，患者自然受孕，則終止本次試驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 臨床分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將60例患者分為治療組和對照組，每組30例。

1.3.2 治療方案

1.3.2.1 治療組 予何氏養(yǎng)巢方口服，1劑/d，早晚各1次，從入組后第1個(gè)月經(jīng)周期開始用藥，連續(xù)服用3個(gè)月經(jīng)周期。何氏養(yǎng)巢方組成：天冬10g，葛根20g，當(dāng)歸10g，白芍10g，柏子仁10g，菟絲子10g，肉蓯蓉10g，覆盆子10g，以上中藥均來源于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院中藥房。

1.3.2.2 對照組 口服DHEA（商品名：順珈儂，產(chǎn)地：中國香港，規(guī)格：60粒/瓶，批號：DN165152），3次/d，1粒/次。從入組后第1個(gè)月經(jīng)周期開始用藥，連續(xù)服用3個(gè)月經(jīng)周期。

1.3.3 促排卵方案 兩組均采用PPOS方案。月經(jīng)周期的第2～4天起開始服用黃體酮軟膠囊（商品名：安琪坦，產(chǎn)地：西班牙Cyndea Pharma S.L藥廠，規(guī)格：0.1g/粒，批號：H20160265）0.2g/d；同時(shí)予注射用尿促性素針（商品名：樂寶得，產(chǎn)地：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，規(guī)格：75U/支， 批號：H10940097）150～225U/d肌肉注射；至扳機(jī)日，予以注射用絨促性素針（商品名：注射用絨促性素，產(chǎn)地：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，規(guī)格：2 000U/支， 批號：H44020673）2 000U及醋酸曲普瑞林注射液（商品名：達(dá)必佳，產(chǎn)地：德國輝凌制藥，規(guī)格：0.1mg/支，批號：H20100365）0.1mg肌肉注射。 注射后35～36h取卵，然后行常規(guī)IVF。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般資料 年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、流產(chǎn)次數(shù)、不孕年限等。

1.4.2 卵巢儲備功能相關(guān)指標(biāo) AMH水平、AFC數(shù)量、基礎(chǔ)FSH、LH水平及FSH/LH。

1.4.3 卵母細(xì)胞數(shù)量、質(zhì)量及發(fā)育潛能指標(biāo) （1）獲卵數(shù)、成熟卵率：成熟卵率（%）=成熟卵數(shù)/獲卵數(shù)×100%；（2）受精數(shù)、受精率：受精率（%）=兩原核卵子數(shù)/成熟卵數(shù)×100%；（3）卵裂胚胎數(shù)、卵裂率：卵裂率（%）=卵裂胚胎數(shù)/兩原核卵子數(shù)×100%；（4）可利用胚胎數(shù)、可利用胚胎率：可利用胚胎率（%）=可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%；（5）優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率：優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%。

1.4.4 其他指標(biāo) 促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量及時(shí)間、周期取消率；腎虛證中醫(yī)證候評分；治療前后生命體征、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖，即安全性指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.0軟件及SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，如果數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗(yàn)；如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，組內(nèi)比較采用Wilcoxon秩檢驗(yàn)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例納入情況 治療過程中，治療組自然妊娠1例，無脫落；對照組脫落1例。

2.2 兩組患者基線資料比較 兩組患者的基線比較如下，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P＞0.05）。 見表1。

表1 兩組患者基線特征比較

2.3 兩組患者療效比較 治療過程中，治療組1例患者自然受孕，對照組1例脫落，故兩組各有29例患者納入統(tǒng)計(jì)。

2.3.1 兩組患者治療前后卵巢功能相關(guān)血清指標(biāo)比較 與治療前比較，治療后治療組與對照組血清AMH水平均提高，F(xiàn)SH水平及FSH/LH值均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較顯示，何氏養(yǎng)巢方降低FSH水平的效果優(yōu)于DHEA（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組患者治療前后卵巢功能相關(guān)血清指標(biāo)比較

2.3.2 兩組患者中醫(yī)癥候總積分比較 治療前兩組患者中醫(yī)癥候總積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療后治療組中醫(yī)癥候總積分低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與治療前比較，治療后治療組中醫(yī)癥候總積分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組中醫(yī)癥候總積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。說明何氏養(yǎng)巢方顯著改善了高齡DOR不孕癥患者的腎虛證候。

表3 兩組患者中醫(yī)癥候總積分比較（分）

2.3.3 兩組患者IVF周期相關(guān)指標(biāo)比較 在PPOS方案實(shí)施過程中，治療組1例患者因無成熟卵泡取消周期，對照組2例患者因無成熟卵泡取消周期，故治療組28例納入IVF結(jié)局統(tǒng)計(jì)，對照組27例納入IVF結(jié)局統(tǒng)計(jì)。治療組在Gn用量、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、卵裂胚胎數(shù)、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)等方面均顯著優(yōu)于對照組（P＜0.05）。 見表4。

表4 兩組患者IVF周期相關(guān)指標(biāo)比較

此外，除成熟卵率外，兩組患者的受精率、卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率等參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖1。

圖1 兩組患者IVF周期中相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 兩組患者安全性指標(biāo)比較 兩組患者治療前后各項(xiàng)安全性指標(biāo)均處于正常范圍，治療期間未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

3 討論

DOR表現(xiàn)為女性卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的下降，從而導(dǎo)致生育力減退。祖國醫(yī)學(xué)雖然沒有DOR的病名記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于“不孕癥”“血枯”等范疇?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩唬骸芭悠邭q，腎氣盛，二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時(shí)下，故有子……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！蹦I為“腎-天癸-沖任-胞宮”軸正常運(yùn)行的核心[18]，在其主導(dǎo)下，天癸成熟泌至，促使任脈所司精、血、津液充沛通達(dá)，沖脈所聚臟腑之血充盛，即任通沖盛，二脈相資，并使沖任二脈匯聚臟腑之血溢入胞宮，既孕則營養(yǎng)胎元，未孕則化為月經(jīng)依時(shí)而下[19]。腎虛精血不足，天癸乏源，沖任血?？仗?，源斷其流，血海不能按時(shí)由滿而溢，則致閉經(jīng)、不孕等，故而腎虛是DOR的主要病機(jī)，因此中醫(yī)臨床治療本病常以補(bǔ)腎填精為主[20-21]。談勇等多位著名中醫(yī)婦科及生殖專家主持的臨床研究顯示，在IVF前以補(bǔ)腎為基礎(chǔ)的中藥進(jìn)行預(yù)治療，可顯著改善DOR或卵巢低反應(yīng)不孕患者的獲卵數(shù)量和質(zhì)量，提高IVF-ET成功率[22-24]。

何氏養(yǎng)巢方源于“何氏婦科”，在祖?zhèn)黩?yàn)方育麟丸的基礎(chǔ)上化裁而成，由覆盆子、菟絲子、肉蓯蓉、葛根、天冬、當(dāng)歸、白芍、柏子仁八味中藥組成。方中菟絲子味辛而甘，善補(bǔ)腎精，溫而不燥，《本草正義》謂其“陰中有陽，守而能走”[25]；覆盆子酸溫入腎，一則收攝耗散之陰氣而蓄養(yǎng)陰精，二則取類比象，取其累累如珠似卵子之形，又因菟絲子偏補(bǔ)陽氣，覆盆子偏滋陰血，二者相配，寓陽中求陰，陽中求陰，以子補(bǔ)子之意，共為君藥。當(dāng)歸甘溫而潤，補(bǔ)血養(yǎng)血，白芍補(bǔ)血斂陰，酸收性合，兩藥動靜相宜，奏肝腎同補(bǔ)、精血相生之效，肉蓯蓉、天冬補(bǔ)腎益精，并補(bǔ)陰陽，此四味共為臣藥。柏子仁可透心腎、養(yǎng)心神、舒心氣，安定患者焦慮情緒，其為佐藥。葛根一味看似與種子調(diào)經(jīng)無關(guān)，實(shí)則具有起陰氣、升清陽之功，可促諸藥益腎之氣味升發(fā)，故為使藥。全方君臣有序，相與宣攝，重在補(bǔ)腎益精血，使腎精足、陰血充，促進(jìn)卵泡的發(fā)育、排出，從而達(dá)到改善卵巢儲備功能的目的。

通過超排卵獲得適量、高質(zhì)量的卵子是IVF-ET成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。女性最佳生育年齡是24～28歲，高齡DOR不孕癥患者在IVF過程中容易發(fā)生卵巢反應(yīng)不良，導(dǎo)致獲卵數(shù)量減少、受精卵率和優(yōu)質(zhì)胚胎率亦下降，最終妊娠率下降，是IVF-ET失敗的主要原因[26-27]。DHEA在臨床上被廣泛用于卵巢低反應(yīng)（poor ovarian response，POR）患者的IVF周期，研究表明其能夠顯著提高接受IVF-ET治療的POR患者的卵巢儲備功能，并增加雌二醇峰值水平，改善胚胎質(zhì)量和生育結(jié)局[28]。本研究顯示，何氏養(yǎng)巢方可顯著降低高齡DOR不孕女性的FSH水平及FSH/LH，提高AMH水平，獲卵數(shù)、卵裂胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)等，并降低Gn用量，且效果優(yōu)于DHEA。除成熟卵率外，治療組及對照組在受精率、卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率4個(gè)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)。

本研究證實(shí)，何氏養(yǎng)巢方可以改善腎虛型高齡DOR患者的卵巢功能、卵子質(zhì)量和IVF結(jié)局，而且安全有效，值得臨床推廣。本研究結(jié)果為中醫(yī)藥應(yīng)用于介入輔助生殖技術(shù)中的有效性提供了循證依據(jù)，進(jìn)一步可以結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、體外實(shí)驗(yàn)、多組學(xué)等研究手段，對中醫(yī)藥的作用機(jī)制進(jìn)行深入挖掘。