路少鵬 岳敏 張欣欣 李丹 王文魁 齊永華

摘要：【目的】克隆構(gòu)建利巴韋林（ RBV）單鏈抗體（scFv）基因，對其理化特xing 進行分析并對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行模擬，為后期檢測方法的建立及分子改造提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳苑置诶晚f林抗體的雜交瘤細胞株總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)擴增抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），然后以柔性連接短肽（Gly4Ser）3為接頭拼接完整的scFv-RB V-利用生物信息學方法對scFv-RBV的理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)功能進行預測分析。【結(jié)果】構(gòu)建的scFv基因編碼240個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26 162.27 Da，理論等電點（pI）為8 57。在二級結(jié)構(gòu)中，p一折疊（3917%）和無規(guī)卷曲（45.41%）占主導地位，a-螺旋（5.42%）和β-轉(zhuǎn)角（10%）相對較少。在三級結(jié)構(gòu)中，VH和VL區(qū)域被Linker相互牽拉靠近，形成典型的口袋樣形狀的空問構(gòu)象，符合單鏈抗體的結(jié)構(gòu)特征，理論上可以與RBV抗原特異性結(jié)合?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建scFv-RBV基因，并利用生物信息學方法預測分析scFv的二級、三級結(jié)構(gòu)，該結(jié)果可為后期進行單鏈抗體的表達、純化及定向進化提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：利巴韋林（ RBV）;單鏈抗體（scFv）;生物信息學;結(jié)構(gòu)預測

中圖分類號：S 859.1

文獻標志碼：A

文章編號：1008-03 84（ 2021） 08-0909-08

Construction and Structure of Anti-ribavirin Single-chain Antibody Gene

LU Shaopeng 1.2， YUE Min 2. ZHANG Xinxin 2. LI Dan 2. WANG Wenkui l*， QI Yonghua 2*

（ 1. College of Animal Medicine. Shanxi Agriczdtural University， Taigu， Shanxi 030801 . China; 2. Henan Engineering

Laboratoryfor Molecular Diagnosis of Animal Diseases， Xinxiang University， Xinxiang， Henan

453000. China ）

Abstract： 【Objective】 The ribavirin （RBV） single-chain antibody （scFv） gene was constructed. cloned. andphysiochemically analyzed to establish a model for the detection method development and molecular modification.【Method】 Using the total RNA of the hybridoma cell line secreting RBV antibody as a template， both heavy-chain （ VH） andlight-chain variable （VL） regions of the antibody were amplified by RT-PCR. Then the short peptide （Gly4Ser） 3 wasemployed as the splicing joint to construct the complete scFv-RB V. Bioinformatics methods were applied to predict and analyzethe physiochemical properties， protein structure. and functions of the gene. 【Results】The constructed scFv-RBV encoded240 amino acids with a relative molecular mass of 26.162.27 Da and a theoretical isoelectric point of 8.57. The secondarystructure of the protein consisted of 39.17% p-sheets. 45.41% random coils. 5.42% a-helices， and 10% p-turns. In the tertiarystructure， the VH and VL regions were pulled close by Linker， forming a typical pocket-like spatial configuration that conformsto the structural characteristics of a single-chain antibody. Theoretically， it could bind specifically to RBV antigens.【Conclusion】 The successfully constructed scFv-RBV in this study afforded the utilization of bioinformatics methods topredict and analyze the secondary and tertiary structures of scFv gene paving the way for further studies on the expression，purification， and directed evolution of the single-chain antibodies.

Key words： ribavirin （ RBV） ;

single chain antibody fragment （ scFv） ： bioinformatics;

protein structure

0 引言

【研究意義】利巴韋林（ Ribavirin，RBV）是一種廣譜抗病毒藥物，在畜牧業(yè)中被廣泛用于治療禽流感、口蹄疫、流行性腹瀉、狂犬癥等疾病[1-2]。長期使用或濫用可導致動物機體對病毒抵抗力降低，同時也會殘留于動物性食品中，因此，我國禁止在畜禽養(yǎng)殖過程中使用RBV[3-4]。免疫學檢測技術(shù)作為小分子化合物檢測的主要手段之一，其核心試劑是高適應(yīng)性的檢測抗體。單鏈抗體（ single chain antibodyfragment，scFv）是從單克隆抗體衍生而來的一種基因重組抗體，大小僅有完整抗體的六分之一，但具有與親本抗體完全相同的抗原結(jié)合位點[5]。通過分子生物學方法可以將單克隆抗體的VH和VL基因通過柔性連接肽進行拼接，拼接而成的重組蛋白具有分子質(zhì)量小、特異性及穿透力強等優(yōu)點，而且可以在分子水平上對其進行定向改造，以便提高其親和力和特異性，從而更加便捷高效地為體外快速檢測小分子化合物殘留檢測方法的建立提供所需的核心試劑[6]。生物信息學作為一門綜合計算機科學、信息技術(shù)的學科之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測、藥物設(shè)計等方面發(fā)揮了重要作用[7-8]。采用生物信息學技術(shù)對單鏈抗體序列進行結(jié)構(gòu)功能分析，后期通過定向改造有望獲得高親和力和靈敏度的單鏈抗體?！厩叭搜芯窟M展】目前針對利巴韋林藥物殘留檢測方法主要有高效液相色譜法（ HPLC）、毛細管電泳法、分光光度法及比色法等，這些方法可有效檢測血清[9]、血漿[10]、紅細胞[11]、白龍散等中藥散劑[12]中的利巴韋林殘留?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于利用利巴韋林單鏈抗體檢測藥物殘留的相關(guān)報道較少，針對利巴韋林單鏈抗體結(jié)構(gòu)的解析及功能研究的報道更是少之又少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究在獲得分泌利巴韋林抗體的雜交瘤細胞株基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)擴增出抗體的VH基因和VL基因，然后拼接成scFv-RBV，進行重組質(zhì)粒構(gòu)建。后續(xù)利用生物信息學方法，預測分析scFv-RBV的理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)，并利用同源建模模擬其三級結(jié)構(gòu)。該研究結(jié)果可為后期進行利巴韋林單鏈抗體的親和力成熟、抗體蛋白表達及純化提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗scFv-RBV單克隆抗體雜交瘤細胞株由新鄉(xiāng)學院動物疫病分子診斷河南省工程實驗室提供;核酸蛋白分析儀購自美國Beckman-Coulter公司;梯度PCR反應(yīng)儀和高速低溫離心機購白美國Thermo Fisher公司;膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司;總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、HS DNA Polymerase、T4 DNA連接酶及大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞均購白大連Takara公司;限制性內(nèi)切酶ⅣotI和SfiI購白New England Biolabs公司;其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2引物設(shè)計

按照文獻13]設(shè)計擴增VH及VL基因的引物，并引入合適的酶切位點SfiI和Not I，Linker選擇較常用的（ Gly4Ser）3形式[14];具體引物序列設(shè)計如表1所示（引物序列由上海生工生物工程有限公司合成）。

1.3雜交瘤細胞的復蘇

為防止細胞在活化復蘇時被污染，迅速從液氮罐中取出本實驗室保存的可分泌利巴韋林抗體的雜交瘤細胞株，并迅速置于37℃恒溫水浴鍋中緩慢晃動使其迅速解凍。將解凍后的雜交瘤細胞用10 mLDMEM完全培養(yǎng)基進行稀釋，1000 r·mm-1離心5min，棄去上清液，保留沉淀。然后重新加入10 mL DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞（5% C02），并隔天對細胞進行傳代以保證細胞活力。當細胞數(shù)量生長到8×10 6個·瓶-1，選取生長狀態(tài)良好的細胞提取總RNA。

1.4總RNA的提取及cDNA的合成

為避免外界環(huán)境污染而降解RNA，因此，在超凈工作臺中按照RNA提取試劑盒說明書提取雜交瘤細胞總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA（表2）。

1.5 VH和VL基因的擴增

以cDNA為模板，表1的VH和VL的上下游引物，利用PCR技術(shù)分別擴增抗體的VH和VL基因（表3）。擴增結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，然后回收純化符合目的大小片段的VH和VL基因，純化后的產(chǎn)物于20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 scFv-RBV基因的構(gòu)建

分別以VH和VL基因片段為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)擴增VH-1inker和VL-1inker（表4）;擴增結(jié)束后，以上述反應(yīng)產(chǎn)物混合液為模板，表1中的VH-1inker-For和VL-1inker-Back為引物，擴增scFv-RBV基因（表5），然后使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。

1.7 重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv的構(gòu)建與鑒定

利用SfiI和Ⅳot I內(nèi)切酶將scFv-RBV基因和pCANTAB-5E質(zhì)粒進行雙酶切，然后使用T4 DNA連接酶將酶切后的scFv與pCANTAB-5E質(zhì)粒進行連接（表6），從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv。采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細胞，然后均勻涂布到含氨芐青霉素（ AMP）抗性的LB固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)14-- 16 h。次日挑取3個單菌落進行菌液PCR鑒定，然后將陽性菌進行基因測序。

1.8 scFv-RBV蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測

利用DANMAN軟件將測序得到的scFv-RBV核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，然后使用NCBI分析氨基酸序列的同源性和IgG結(jié)構(gòu)域。采用ExPASyProtParam（ https：//web.expasy.org/protparam/）計算其蛋白分子量、等電點、氨基酸組成等參數(shù)[15]，并以SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au-tomat.pl？page-npsasopma.html）預測分析scFv-RBV的二級結(jié)構(gòu)。在SWISS-MODEL（ http：//swissmodel.expasy.org/）中輸入scFv-RBV的氨基酸序列，推測scFv-RBV蛋白的三級結(jié)構(gòu)并進行同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 scFv可變區(qū)基因的擴增結(jié)果

按照RNA提取試劑盒說明書提取雜交瘤細胞總RNA，結(jié)果如圖1所示。RNA的條帶從上到下分別為28、18和5S，電泳條帶無拖尾現(xiàn)象，表明RNA較完整。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別擴增抗體的VH和VL基因，圖2結(jié)果表明，擴增的VH和VL片段大小均在350 bp左右，且擴增得到的條帶單一，與預期結(jié)果相符。

2.2 重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv的構(gòu)建及序列鑒定結(jié)果

將VH和VL基因等摩爾濃度混勻，采用重疊延伸PCR構(gòu)建scFv-RBV基因（VH-Linker-VL）。圖3結(jié)果表明，擴增的條帶在750 bp左右有明顯的目的條帶。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv電擊轉(zhuǎn)化進DH5a感受態(tài)細胞后，菌液PCR鑒定結(jié)果表明（圖4），在750 bp左右有明顯的目的條帶，初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將陽性菌液送去基因測序，測序結(jié)果正確的菌液加終濃度為40%的甘油進行保菌， 80℃保存。

2.3 scFv-RBV氨基酸序列分析

利用DANMAN軟件將測序結(jié)果得到的核苷酸序列翻譯成氨基酸，經(jīng)IMGT劃分得知（圖5），VH和VL序列中均有3個互補決定區(qū)（CDR）和4個框架區(qū)（ FR），且序列內(nèi)無終止密碼子。其中，VH基因編碼118個氨基酸，位于Linker上游;VL基因編碼107個氨基酸，位于Linker下游。VH和VL依靠Linker（ Gly4Ser）3相連接。

2.4 scFv蛋白理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

2.4.1 scFv-RBV氨基酸序列比對分析結(jié)果 利用NCBI在線分析編碼scFv-RBV基因的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，scFv存在抗體中的典型可變結(jié)構(gòu)域（ IGV），且符合鼠源單鏈抗體可變區(qū)的所有特征，并與多種數(shù)據(jù)庫中已登錄的鼠源單鏈抗體有較高的同源性。其中，與Ig heavy chainV region（ PRI）-mouse（pirIA47329）同源性高達70%。

2.4.2 scFv-RBV蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)預測分析結(jié)果 利用ExPASy ProtParam對scFv-RBV的理化性質(zhì)分析可知，scFv-RBV編碼240個氨基酸，分子式為Cl l79 Hl 795 N311 0364 S8，原子數(shù)為3657，相對分子質(zhì)量為26406.57 Da，理論等電點（PI）為8.76，不穩(wěn)定系數(shù)為37.79，親水性評估值為0.372，推測該蛋白屬于親水性的穩(wěn)定蛋白。二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明（圖6），該蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲（45.42%）和β-折疊（39.17%）占主導地位，a-螺旋（5.42%）和β-轉(zhuǎn)角（10%）相對較少。

2.4.3 scFv-RBV蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模 經(jīng)與PDB數(shù)據(jù)庫進行序列比對發(fā)現(xiàn)，PDB ID 5kov.1所編碼的氨基酸序列與scFv-RBV所編碼的氨基酸序列有較高同源性（68.20%）。運用在線T具SWISS- Model進行scF-RBV的同源模型構(gòu)建。圖7結(jié)果表明，VH和VL主要由無規(guī)卷曲折疊形成，連接肽Linker使兩者牽拉靠近，形成一個有利于抗原結(jié)合的凹槽結(jié)構(gòu)，理論上具有良好的抗原結(jié)合活性。

3討論

利巴韋林白1972年合成后，在臨床上得到了長期廣泛的應(yīng)用，后因其導致動物中毒、免疫抑制、藥物殘留等危害而被國家禁用[16]。但由于其價格低廉，治療效果好等原因，部分不法分子依然在動物養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用。因此，開發(fā)便捷、高效、靈敏的檢測方法迫在眉睫。在眾多藥物殘留檢測方法中，基于抗原抗體特異性結(jié)合建立的免疫分析法，由于操作簡單、結(jié)果呈現(xiàn)快速、通量高，目前已成為檢測動物源性食品中藥物殘留的重要手段之一，其中抗體是免疫分析法的核心試劑[17。

抗體是免疫診斷方法的基礎(chǔ)，也是病原體檢測的一個重要手段[18]。早在19世紀末期，KOHLER等[19]便利用基因工程方法制備了單克隆抗體，該制備技術(shù)的出現(xiàn)使規(guī)?；苽涓咛禺愋?、均質(zhì)性抗體成為可能，不僅為生物學和醫(yī)學研究打開了新世界的大門，同時也為疾病診斷與治療提供新工具。然而由于單克隆抗體制備過程復雜，且市場價格高昂，在一定程度上限制了其臨床使用。隨著基因工程抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，單鏈抗體以單克隆抗體衍生物的身份走進人們的視野。與傳統(tǒng)單克隆抗體相比，單鏈抗體不僅保留著與親本抗體相同的特定抗原結(jié)合特性，而且成本低、產(chǎn)率高、易與其他蛋白質(zhì)融合形成有預期功能的抗體分子，目前已在醫(yī)療診斷、治療和小分子化合物檢測等方面推廣應(yīng)用[20-21]。李彤彤等[22]以抗犬細小病毒（ CPV）的雜交瘤細胞株為基礎(chǔ)，構(gòu)建的重組單鏈抗體具有與親本抗體相同的免疫活性，免疫效價為1：20;陳倩等[23]基于呋喃唑酮單鏈抗體建立了呋喃唑酮快速檢測法，相較于親本呋喃唑酮單克隆抗體有更廣的檢測范圍和更高的特異性和穩(wěn)定性，其半數(shù)抑制濃度（ IC50）值為13.01 ng·mL-l，檢出限為1.28 ng·mL-l。此外，伴隨著分子生物學和生物信息學技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測及理化性質(zhì)的詳細分析也變得越來越容易。其中，同源建模法是目前用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測的常用方法之一，主要是通過與PDB數(shù)據(jù)庫中目前已知序列的X射線晶體衍射做對比，而從中選取與模板具有高度保守性的氨基酸序列來構(gòu)建模型。在對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行同源建模時，要求序列的一致性至少大于30%，且序列相似度越高，結(jié)構(gòu)和功能越相似[24]。而基于抗體的氨基酸序列和預測結(jié)構(gòu)，對一些特定位置的氨基酸進行定向突變可用于提高抗體親和力和特異性。張雪等[25]根據(jù)羊口瘡病毒（ ORFV）單克隆抗體構(gòu)建出scFv基因，成功對抗體結(jié)構(gòu)進行預測分析，并進一步了解和驗證互補決定區(qū)（ CDR）與ORFV的B細胞抗原表位的特異性結(jié)合的分子識別機制;曹子健等[26]通過分析構(gòu)建的沙拉沙星單鏈抗體的序列及結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建出抗體的三維模型，并與喹諾酮類藥物進行分子對接，發(fā)現(xiàn)色氨酸和酪氨酸是抗體與藥物小分子有相互作用的關(guān)鍵氨基酸;謝三磊等[27]對構(gòu)建的金剛烷胺單鏈抗體進行序列分析、模型建立和分子對接后，將關(guān)鍵氨基酸甘氨酸定向突變?yōu)楸奖彼幔贵w的靈敏度較突變前提高了3.9倍;段長飛等[28]從能分泌抗阿莫西林單鏈抗體的雜交瘤細胞人手構(gòu)建了單鏈抗體，通過采用生物信息學方法分析抗體序列后，將輕鏈互補決定區(qū)（ CDR） L3的關(guān)鍵氨基酸絲氨酸定向突變?yōu)樘於０泛凸劝彼?，結(jié)果表明較突變前靈敏度分別提高了2.2倍和2.5倍。綜上所述，為進一步提高抗體的親和力和靈敏度，可以從生物信息學方法人手，通過對抗體的序列進行分析，然后對抗體進行進一步的表達和純化及進化。從側(cè)面反應(yīng)生物信息學的理論和實驗的結(jié)合可以幫助研究者更加深入的了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為進一步明確該抗體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其生物學活性奠定了理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究成功構(gòu)建抗scFv-RBV基因。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，scFv基因編碼240個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26 406.57 Da，理論等電點（pl）為8.76;在二級結(jié)構(gòu)中，B一折疊（39.17%）和無規(guī)卷曲（45.41%）占主導地位，a-螺旋（5.42%）和β-轉(zhuǎn)角（10%）相對較少。在三級結(jié)構(gòu)中，VH和VL區(qū)域相互牽拉靠近，形成典型的口袋樣形狀的空間構(gòu)象，Linker游離于此結(jié)構(gòu)之外，符合scFv的結(jié)構(gòu)特點，理論上具有良好的抗原結(jié)合活性。該結(jié)果可為后續(xù)進行scFv-RBV基因的表達、純化提供重要的參考依據(jù)，同時也為進一步進行利巴韋林單鏈抗體的體外進化，建立利巴韋林殘留免疫快速檢測方法提供強有力的理論支撐。

致謝：新鄉(xiāng)學院動物疫病分子診斷河南省工程實驗室提供實驗平臺，鄆東光、潘鵬濤等老師對本研究予以悉心指導，李夢陽、孫夢月、李文明、李紅、張艷芳、蔣力維等同學給予相關(guān)幫助，謹此致謝！

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（責任編輯：吳宇琳）

收稿日期：2021-03-10初稿;2021-07-12修改稿

作者簡介：路少鵬（ 1995-），男，碩士研究生，主要從事藥物代謝與藥效研究（E-mail： 130990974l@qq.com）

*通信作者：王文魁（ 1962-），男，博士，教授，主要從事畜禽細胞因子研究（E-mail： wenkui2009@Veah.net）：齊永華（1977-），男，

博士，教授，主要從事細菌耐藥性及新藥開發(fā)研究（E-mail： qyh@xxu.educn）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項日（ 2018YFCl602900）