胡 靈，殷 垚，柯國梁，張曉兵

（湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室,長沙410082）

細(xì)胞之間通過化學(xué)信號、電子交換和直接接觸的方式進(jìn)行“對話”，互相交換彼此之間的物質(zhì)和信息，以維持生命體的基本功能并調(diào)節(jié)生命體的生長發(fā)育［1~3］.細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用是多細(xì)胞生物維持正常生命進(jìn)程和功能調(diào)控的關(guān)鍵，是合成多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和多細(xì)胞聚集體的基礎(chǔ)，能夠進(jìn)一步實現(xiàn)高階生物學(xué)功能（如細(xì)胞的增殖與分化、組織和器官的發(fā)育以及免疫反應(yīng)）在體內(nèi)的正常進(jìn)行［4~6］.如，精子和卵子之間通過識別與結(jié)合，并進(jìn)一步通過核的融合形成新的細(xì)胞，從而開始孕育出一個新的生命；除此之外，高等植物細(xì)胞通過胞間連絲、動物細(xì)胞通過間隙連接等通道來實現(xiàn)彼此之間的物質(zhì)交換和信息交流.細(xì)胞間的相互作用一般依賴于膜上受體蛋白的特異性指導(dǎo)和調(diào)控，以適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化［7，8］.不同種類的細(xì)胞通過聚集可形成形態(tài)各異、功能多樣的集群，在生命體內(nèi)和體外發(fā)揮著獨特的生理功能.而細(xì)胞間的作用一旦遭到阻斷或破壞，就會引起正常生理功能的紊亂，導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)疾病和細(xì)胞的癌變等［9~11］.因此細(xì)胞間相互作用的研究與調(diào)控，尤其是研究細(xì)胞間作用的強(qiáng)度和特異性，有助于了解細(xì)胞間的行為，在細(xì)胞功能的機(jī)制研究和疾病的診斷和治療方面具有非常重要的意義.

調(diào)控細(xì)胞間的相互作用首先需要在細(xì)胞表面工程化設(shè)計具有識別功能的分子［12］，如核酸［13］、蛋白質(zhì)［14］及糖類［15，16］等.脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）是遺傳信息的載體.1869年，Miescher分離出了DNA［17］；1953年，Watson和Crick［18］確定了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，開啟了現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究時代.同時，Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則賦予了DNA獨特的識別和組裝能力，使DNA除了作為遺傳信息載體外，還能作為一種新穎的材料應(yīng)用到各個領(lǐng)域.DNA具有易合成、易修飾、可編程性以及生物安全性高等優(yōu)點，且通過化學(xué)反應(yīng)共價修飾［19，20］、兩親性基團(tuán)修飾核酸結(jié)構(gòu)［21，22］，或者直接引入親和標(biāo)記物（核酸適體）［23，24］等方法，DNA可以錨定在細(xì)胞膜表面，從而模擬細(xì)胞膜表面天然受體的功能，實現(xiàn)細(xì)胞表面的信號識別和響應(yīng)，并精確調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用.相比于對細(xì)胞進(jìn)行基因改造，基于DNA的調(diào)控策略具有操作簡單和破壞性小等優(yōu)點，同時DNA結(jié)構(gòu)也能對細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化做出智能響應(yīng)，以精確調(diào)控細(xì)胞間的組裝行為［25~27］，因此近年來引起了廣泛關(guān)注.

本文綜述了基于DNA調(diào)控細(xì)胞間相互作用的應(yīng)用研究（圖1）.首先，總結(jié)了寡核苷酸鏈雜交、受體-配體結(jié)合、核酸適體靶向識別等操縱多細(xì)胞組裝行為的策略；其次分別介紹了調(diào)控細(xì)胞間相互作用的外部手段，包括pH、金屬離子、DNA激活鏈等調(diào)控手段；最后，總結(jié)了基于DNA調(diào)控細(xì)胞間相互作用在各個領(lǐng)域的應(yīng)用，主要包括測量和成像細(xì)胞間作用力、體外構(gòu)建三維（3D）聚集體、細(xì)胞通訊以及細(xì)胞免疫治療4個方面.通過系統(tǒng)地介紹和總結(jié)基于DNA調(diào)控細(xì)胞間相互作用的研究，有助于拓展該領(lǐng)域的研究空間，為智能操縱細(xì)胞間行為、定制組織工程、模擬細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)以及細(xì)胞免疫治療提供新的思路.

Fig.1 Diagram of the regulation of cell?cell in?teractions based on DNA nanostructures

1 組裝策略

在細(xì)胞膜表面組裝各類分子或結(jié)構(gòu)，以誘導(dǎo)細(xì)胞主客體之間的識別和相互作用，此過程模擬了自然界中細(xì)胞間的組裝過程.通過人為操縱細(xì)胞間的相互作用，有助于更深入地了解和研究多細(xì)胞生物中細(xì)胞聚集在生理和病理過程中的功能和命運，并將其拓展應(yīng)用到各個細(xì)胞和組織層面.利用人工合成DNA鏈來實現(xiàn)細(xì)胞間的相互作用是一種有前景的非基因手段.本文總結(jié)了以下幾種基于DNA的細(xì)胞間相互作用調(diào)控策略：寡核苷酸鏈雜交、受體-配體識別以及核酸適體靶向識別.

1.1 寡核苷酸鏈雜交

基于Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則和細(xì)胞膜表面工程技術(shù)，通過將DNA鏈修飾到細(xì)胞膜表面，利用DNA雜交實現(xiàn)細(xì)胞間的連接，從而實現(xiàn)自下而上的細(xì)胞組裝.如圖2（A）所示，Gartner等［28］開發(fā)了一種DNA程序化的細(xì)胞組裝方式（DPAC），他們將兩條互補(bǔ)的寡核苷酸單鏈通過疏水作用插入到不同的細(xì)胞膜表面，通過DNA雜交實現(xiàn)細(xì)胞間的組裝.相比于依賴細(xì)胞膜表面有限的受體的相互作用，利用DNA雜交控制細(xì)胞間直接物理接觸的方法能在細(xì)胞膜表面錨定大量DNA分子，從而能在一定程度上提高細(xì)胞間的組裝效果［29］.寡核苷酸的序列復(fù)雜度和長度都被證實對細(xì)胞間的組裝效果有很大影響.因此，為了保證細(xì)胞之間的作用效果，針對不同的細(xì)胞類型需要對膜表面寡核苷酸鏈的長度進(jìn)行優(yōu)化.通常，對大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞而言，20個堿基左右的長度就能滿足膜表面的有效組裝［30，31］.但是對于膜表面存在糖萼的細(xì)胞（如Jurkat細(xì)胞［32］），由于糖萼具有一定厚度（＞20 nm），其空間位阻會影響膜表面寡核苷酸之間的雜交，從而降低細(xì)胞的組裝效率，所以在設(shè)計DNA序列時需要選擇更長的寡核苷酸鏈（如60~80個堿基），以實現(xiàn)細(xì)胞間的有效連接.序列的復(fù)雜程度對細(xì)胞組裝效率也有一定影響，往往復(fù)雜的雜交序列會導(dǎo)致組裝效率降低［30］.同時，細(xì)胞的密度和細(xì)胞膜表面DNA的密度也會影響細(xì)胞間的組裝效率，因此在進(jìn)行研究時需要對這兩個條件進(jìn)行優(yōu)化，以保證最佳的作用效果.

雖然借助于寡核苷酸鏈的堿基配對原則可實現(xiàn)相同或不同細(xì)胞系的連接，但是目前基于該設(shè)計的研究主要集中于單價體系，即在細(xì)胞膜表面修飾的DNA鏈往往是單鏈DNA，在研究過程中容易導(dǎo)致以下問題［33］.首先，單鏈DNA在細(xì)胞膜上不穩(wěn)定，容易從細(xì)胞膜表面脫落，因此在細(xì)胞膜上的保留時間短，不利于長時間研究；其次，通過疏水作用插入磷脂雙分子層中的兩親性DNA共軛物（如膽固醇-DNA）會自發(fā)形成膠束，從而影響細(xì)胞膜上DNA的密度；同時，細(xì)胞膜錨定的單鏈DNA容易通過內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，且易被降解，影響其功能的實現(xiàn).借助DNA納米結(jié)構(gòu)，可以設(shè)計出多價體系，產(chǎn)生優(yōu)于單價體系的性能，這在一定程度上能夠克服上述問題.Shi等［34］發(fā)展了一種兩步法實現(xiàn)細(xì)胞膜表面的多價分子標(biāo)記：第一步將DNA引發(fā)鏈通過點擊反應(yīng)修飾在細(xì)胞膜上，第二步再加入DNA發(fā)卡鏈單體在細(xì)胞膜表面進(jìn)行雜交鏈反應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR），從而獲得多價的DNA標(biāo)記［圖2（B）］.通過HCR引入多價修飾，該方法可使細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用效率顯著提高.

細(xì)胞膜上的DNA探針往往受細(xì)胞膜的流動性、復(fù)雜的細(xì)胞外環(huán)境的影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不夠理想、定向性較差，從而影響了細(xì)胞間的相互作用.DNA自組裝納米結(jié)構(gòu)，如DNA四面體［35］、DNA折紙［25，26］（即DNA origami）等，具有機(jī)械剛性大及幾何穩(wěn)定性高等優(yōu)點，有望解決這些問題.Castro等［25］將DNA折紙結(jié)構(gòu)引入到細(xì)胞膜表面，并通過DNA序列特異性雜交實現(xiàn)了細(xì)胞的組裝［圖2（C）］.DNA折紙有以下優(yōu)勢：（1）DNA折紙的可尋址性能定義連接位點的數(shù)量、方向和種類；（2）DNA折紙的剛性大結(jié)構(gòu)有利于提高細(xì)胞間的組裝效率和細(xì)胞間交流的穩(wěn)定性；（3）DNA折紙可作為一種細(xì)胞表面的具有識別功能的“突觸分子”，模擬功能大分子的作用調(diào)控各種復(fù)雜生物過程.此外，Tan等［35］選擇了成本更低、操作更簡單的兩親性DNA四面體，構(gòu)建了一種更穩(wěn)定、有效的、多功能的膜錨定納米平臺，以專門調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用［圖2（D）］.實驗數(shù)據(jù)表明，具有3個疏水頂點的DNA四面體在細(xì)胞膜表面的錨定效果更好，穩(wěn)定性更高，并具有更低的內(nèi)化率.他們［35］在DNA四面體納米平臺上，通過DNA雜交實現(xiàn)細(xì)胞間的直接物理接觸，從而啟動細(xì)胞間的通訊.因此，得益于DNA強(qiáng)大的可編程性和DNA納米結(jié)構(gòu)的多樣性，細(xì)胞膜表面功能化的DNA能作為一種分子識別探針，用于指導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞間的組裝，從而進(jìn)一步探究細(xì)胞間的相互作用在生理和病理條件下對單細(xì)胞和多細(xì)胞生物命運和功能的影響.

Fig.2 Scheme of cell assembly methods based on complementary hybridization of oligonucleotide chains

1.2 受體-配體識別

細(xì)胞膜上的蛋白受體豐富，具有識別并結(jié)合環(huán)境中特異性化學(xué)分子的功能，是細(xì)胞與外界環(huán)境交流的通道之一.與蛋白受體結(jié)合的化學(xué)分子統(tǒng)稱為配體，如神經(jīng)遞質(zhì)、藥物分子和抗原等，它們與蛋白受體之間的結(jié)合具有高度的特異性.當(dāng)配體結(jié)合到靶細(xì)胞上的受體時，有的能改變靶細(xì)胞膜功能，有的能引發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)下游的生理化學(xué)反應(yīng)，以保證細(xì)胞的正常生理功能.隨著細(xì)胞膜表面工程的興起，合理設(shè)計并調(diào)控細(xì)胞膜表面受體-配體結(jié)合行為有利于進(jìn)一步了解其生理意義，也大大促進(jìn)了人為控制細(xì)胞間相互作用的發(fā)展［12］.目前，人為改造細(xì)胞膜表面受體來調(diào)控細(xì)胞間的行為已經(jīng)運用到細(xì)胞遷移、細(xì)胞治療及組織工程等領(lǐng)域［3，28，36］.如，著名的CAR-T細(xì)胞療法（嵌合抗原受體T細(xì)胞療法）［37，38］通過基因工程改造免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞表面表達(dá)嵌合抗原受體，從而增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞對癌細(xì)胞的殺傷作用.但是基因工程也存在一系列挑戰(zhàn).如工程的操作難度大，而且直接對細(xì)胞進(jìn)行的改造不可逆，可能引起不可預(yù)測的臨床安全問題.因此人們將研究方向轉(zhuǎn)向?qū)?xì)胞的非基因改造，尤其是引入生物安全性更高的合成DNA鏈來人為操縱細(xì)胞間的行為［14，16］.單純的寡核苷酸鏈雜交僅僅依賴于序列的雜交，缺乏細(xì)胞之間作用的特異性.圖3（A）所示的連接方法是目前一種常用的替代策略［39~45］，將配體共價或非共價修飾到細(xì)胞膜表面，由表面修飾的配體特異性作用靶細(xì)胞上的受體，進(jìn)而調(diào)控下游的細(xì)胞間作用.另外，也可將配體修飾在合成DNA鏈或DNA納米結(jié)構(gòu)上［39，40，42，44，45］，該DNA探針插入細(xì)胞膜中，通過配體-受體的結(jié)合，拉近與特定靶細(xì)胞之間的距離，一方面能通過熒光量化和成像特定受體-配體介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用力，另一方面也能調(diào)控細(xì)胞間的通訊和交流［圖3（B）］.

Fig.3 Scheme of cell assembly methods based on receptor?ligand interaction［39］

1.3 核酸適體靶向識別

雖然特定的受體-配體能決定細(xì)胞間相互作用的類型，但是在細(xì)胞膜上修飾可特異性靶向的表面分子可以人為拓展細(xì)胞間相互作用的應(yīng)用范圍.核酸適體（Aptamer）被稱為化學(xué)抗體，是一類在體外篩選出的具有靶向性的寡核苷酸分子片段，具有特異性強(qiáng)、親和力高等優(yōu)點，且識別范圍非常廣泛（從小分子、離子、蛋白到細(xì)胞、組織等）［46，47］.同時，相比于抗體，核酸適體的分子量更小，具有更好的組織穿透深度和更小的免疫原性，且核酸適體容易進(jìn)行化學(xué)修飾，可以滿足不同應(yīng)用中的靶向需求.因此，在細(xì)胞間特異性相互作用的調(diào)控方面具有獨特的優(yōu)勢.Tan等［48］提出了一種基于核酸適體靶向癌細(xì)胞的方式來誘導(dǎo)細(xì)胞的組裝，以模擬自然過程中細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊交流［圖4（A）］.為了進(jìn)一步提高親和力，Liu等［49］在DNA雙鏈支架延伸多價雙功能的核酸適體以增強(qiáng)細(xì)胞間相互作用［圖4（B）］.實驗結(jié)果表明，多價適配體比單價適配體的穩(wěn)定性更強(qiáng)，靶向細(xì)胞的能力也更強(qiáng)，能達(dá)到與雙特異性抗體相同的細(xì)胞間相互作用效率［50］，為后續(xù)細(xì)胞層面的應(yīng)用提供更穩(wěn)定、更有效的人工操縱手段.

Fig.4 Scheme of cell assembly methods based on aptamer targeting strategy

綜上所述，寡核苷酸鏈雜交、受體-配體識別以及核酸適體靶向識別3種細(xì)胞之間的連接方式都依賴于DNA強(qiáng)大的功能，不同的方式具有各自的優(yōu)勢和局限，因此需要根據(jù)具體研究場景選擇最合適的體系.寡核苷酸鏈雜交策略的優(yōu)勢在于設(shè)計簡單、易修飾、易合成以及成本較低，但是也存在易內(nèi)化、易降解、錨定穩(wěn)定性差和易自發(fā)形成膠束的缺點；受體-配體識別策略具有特異性好，親和力強(qiáng)等優(yōu)點，但是存在配體多為蛋白、不穩(wěn)定、易發(fā)生降解等不足；核酸適體靶向識別策略的優(yōu)勢在于易合成、易修飾、特異性強(qiáng)以及種類多，但是容易受到鹽離子等環(huán)境的影響，且容易降解.

2 調(diào)控手段

在研究細(xì)胞相互作用的過程中，拉近細(xì)胞間的距離可以通過在細(xì)胞膜上錨定各種DNA識別探針或在DNA上修飾識別分子來實現(xiàn)，但是細(xì)胞間相互作用的可激活式調(diào)控也是研究細(xì)胞間作用的重要方向，如，細(xì)胞間的通訊交流往往會因為微環(huán)境的變化而做出相應(yīng)的刺激反應(yīng)［51，52］.目前，已有報道利用細(xì)胞膜表面的天然受體或人工受體的識別功能來探究細(xì)胞對微環(huán)境刺激所作出的響應(yīng)信號［53，54］，尤其是，借助在細(xì)胞膜表面構(gòu)建的DNA納米平臺，在外部刺激下DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化來調(diào)控細(xì)胞間的相互作用，這些研究有助于進(jìn)一步理解和思考外部刺激對細(xì)胞間相互作用的影響.因此，本文總結(jié)了基于DNA納米結(jié)構(gòu)調(diào)控細(xì)胞間相互作用的幾種外部刺激方式.

2.1 pH值

細(xì)胞外pH值是維持細(xì)胞正常生理功能的關(guān)鍵因素，而腫瘤細(xì)胞具有與正常細(xì)胞不同的微酸性外環(huán)境，并且這種特異的腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境有利于其不斷生長、增殖，有效逃脫免疫系統(tǒng)對它的殺傷［55，56］.同時，在腫瘤細(xì)胞的生長過程中，其外環(huán)境中pH值也會發(fā)生細(xì)微的變化.借助DNA納米結(jié)構(gòu)設(shè)計，可利用細(xì)胞外微環(huán)境實現(xiàn)細(xì)胞間相互作用的調(diào)控.三鏈DNA螺旋結(jié)構(gòu)［57］是雙鏈雜交（通過Watson-Crick堿基配對形成）的基礎(chǔ)上，與第3條DNA鏈通過Hoogsteen氫鍵配對的方式形成的，其中三鏈DNA中至少有一條DNA鏈全部為嘌呤序列或嘧啶序列.由于三鏈結(jié)構(gòu)中的Hoosgteen鍵需要胞嘧啶被質(zhì)子化，因此在酸性環(huán)境中更有利于該結(jié)構(gòu)的生成.基于此，引入DNA三鏈螺旋結(jié)構(gòu)來構(gòu)建對pH敏感的納米機(jī)器，可實現(xiàn)細(xì)胞間相互作用的響應(yīng)調(diào)控.Hou等［55］利用該結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了DNA三鏈體到雙鏈的轉(zhuǎn)變，通過細(xì)胞外微環(huán)境pH值的變化來調(diào)控細(xì)胞間的通訊和貨物運輸［圖5（A）］.他們將三鏈DNA納米開關(guān)通過疏水作用錨定在細(xì)胞表面，在酸性條件下形成的三鏈結(jié)構(gòu)能隨著細(xì)胞外pH值的增大而轉(zhuǎn)換為雙鏈結(jié)構(gòu)，并在互補(bǔ)單鏈DNA的配對下連接兩個細(xì)胞.同時，他們進(jìn)一步利用pH響應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化誘導(dǎo)了細(xì)胞間信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和貨物運輸，為細(xì)胞治療提供了一種響應(yīng)型的藥物傳遞機(jī)制.

Fig.5 Regulation of cell?cell interactions based on different stimulus

2.2 金屬離子

生物體內(nèi)的金屬離子具有非常重要的調(diào)節(jié)功能，是生物化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點［58~62］.大多數(shù)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生命代謝過程都與金屬離子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［63］，因此，研究細(xì)胞外微環(huán)境中金屬離子對細(xì)胞生命活動的影響非常關(guān)鍵.2021年，Lu等［53］首次采用脫氧核酶（即DNAzyme）策略實現(xiàn)了在金屬離子觸發(fā)下的多細(xì)胞球體相互作用［圖5（B）］.他們巧妙地將對金屬離子具有特異性識別能力的DNAzyme分子通過疏水作用錨定在細(xì)胞膜上，利用DNAzyme在金屬離子存在下對底物鏈的切割行為來控制細(xì)胞間的組裝和解組裝.同時，他們利用Zn2+，Mg2+特異性DNAzyme偶聯(lián)，設(shè)計了雙因素協(xié)同調(diào)控的雙鏈分子開關(guān)，成功構(gòu)建了“AND”和“OR”邏輯門.最后，他們利用該設(shè)計成功地實現(xiàn)了T細(xì)胞球體和腫瘤細(xì)胞球體之間的相互作用，為未來細(xì)胞遷移治療提供了新的可參考的策略.同樣，Tan等［44］在細(xì)胞膜表面構(gòu)建的動態(tài)DNA納米結(jié)構(gòu)能感知外界環(huán)境的變化，誘導(dǎo)下游的細(xì)胞間相互作用［圖5（C）］.他們將DNA四面體結(jié)構(gòu)作為膜錨定平臺，為探針識別外界環(huán)境變化打下了穩(wěn)定的“地基”.他們的設(shè)計策略是先在DNA四面體上延伸出一段被識別三磷酸腺苷（ATP）的核酸適體捕獲的DNA鏈.在K+的刺激下，PC12細(xì)胞分泌的ATP結(jié)合其核酸適體鏈，從而將原本被捕獲的DNA片段暴露出來，再通過HCR反應(yīng)串聯(lián)多個功能分子來操縱細(xì)胞間的相互作用.該設(shè)計的巧妙之處在于：一方面，利用HCR的多價效應(yīng)和四面體的穩(wěn)定性來增強(qiáng)細(xì)胞間作用的效果；另一方面，又將改造后的細(xì)胞在K+的誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生激活信號，誘導(dǎo)下游對特定細(xì)胞的殺傷作用.因此，他們所構(gòu)建的納米平臺可以運用到各種刺激響應(yīng)的生理事件中，如細(xì)胞間的通訊交流、細(xì)胞的殺傷效應(yīng)等，有利于細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞生命工程的發(fā)展.

2.3 DNA激活鏈

生物體是一個復(fù)雜的反應(yīng)體系，多細(xì)胞行為是維持生命體正常功能進(jìn)行的基礎(chǔ)，人為操縱調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用為多細(xì)胞組裝提供了有效的借鑒方法［64，65］.如，Pei等［66］開發(fā)了DNA反應(yīng)電路可以用來調(diào)節(jié)多細(xì)胞之間的組裝，精確控制通過直接物理接觸的多細(xì)胞行為.如圖5（D）所示，在他們的設(shè)計中，通過引入具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針，加入DNA變構(gòu)劑選擇性激活細(xì)胞組裝途徑，依靠DNA序列可編碼的特點可實現(xiàn)對組裝路線的可控性.同時，他們進(jìn)一步將該反應(yīng)電路應(yīng)用于改造自然殺傷細(xì)胞，通過變構(gòu)激活反應(yīng)電路控制自然殺傷細(xì)胞對癌細(xì)胞進(jìn)行靶向免疫治療.這種設(shè)計不僅能增強(qiáng)細(xì)胞間相互作用的可控性，而且對細(xì)胞免疫治療的效果具有促進(jìn)作用，為多細(xì)胞行為的調(diào)控和應(yīng)用開創(chuàng)了簡單有效的策略.盡管上述方式能夠一定程度上實現(xiàn)細(xì)胞間相互作用的調(diào)控，但是仍然亟需發(fā)展更多刺激手段（如光調(diào)控、新型的離子調(diào)控、蛋白調(diào)控等）和智能調(diào)控策略，以進(jìn)一步豐富和理解環(huán)境對細(xì)胞間相互作用的影響.

3 應(yīng) 用

在研究細(xì)胞間相互作用的過程中，DNA分子已成為強(qiáng)有力的調(diào)控平臺和調(diào)控手段.借助于DNA的可編程性、結(jié)構(gòu)可預(yù)見性、易修飾、易合成以及生物安全性等優(yōu)勢，在人為操縱細(xì)胞行為方面開展了一些有益的探索［30，43］.利用DNA納米結(jié)構(gòu)在細(xì)胞表面工程化所奠定的基礎(chǔ)，將DNA結(jié)構(gòu)作為人工受體錨定在細(xì)胞膜上，通過識別并結(jié)合相鄰細(xì)胞來調(diào)控細(xì)胞間的相互作用，并嘗試將這一工程運用到測量和成像細(xì)胞間作用力、3D組織構(gòu)建、通訊交流及細(xì)胞治療等方面.

3.1 測量和成像細(xì)胞間作用力

細(xì)胞間的機(jī)械作用力對于多細(xì)胞行為具有重要的調(diào)節(jié)意義，力的強(qiáng)弱和方向都可能對細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生影響，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能的正常作用［67，68］.精確測量和高分辨成像細(xì)胞間作用機(jī)械力有助于進(jìn)一步了解這些作用力對生物功能的調(diào)節(jié)行為.目前有幾種測量細(xì)胞間作用力的方式，但其應(yīng)用均受到一定限制.單層應(yīng)力顯微鏡［69］利用測得的細(xì)胞與基質(zhì)的連接作用力來判斷細(xì)胞與細(xì)胞間的作用力，但其作用對象局限于單層細(xì)胞；第2種方式是利用微懸臂來測量單個細(xì)胞對之間的作用［70］，對儀器的精密程度要求較高，且通量較低；第3種方法需要將熒光蛋白整合到細(xì)胞膜上的連接蛋白中，利用熒光蛋白對之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作為分子張力探針進(jìn)行測量［71，72］，但是這種方法需要對細(xì)胞進(jìn)行改造，且熒光蛋白的標(biāo)記效率也會受到細(xì)胞自身的影響.因此，為了開發(fā)出有效的、方便的測量細(xì)胞間作用力的方法，將標(biāo)記熒光的DNA探針錨定在細(xì)胞膜上，以熒光強(qiáng)度的變化指示細(xì)胞間作用力的強(qiáng)度變化［39，69］.如圖6所示的方式或類似的策略，You等［39，41，43］采用DNA張力探針可以有效實現(xiàn)成像和量化細(xì)胞間的作用力.基于以DNA發(fā)卡為基礎(chǔ)的分子張力探針，發(fā)卡鏈在細(xì)胞間分子張力的作用下被拉開，其中伴隨著熒光/猝滅對之間的分離，以熒光團(tuán)的信號強(qiáng)弱來量化細(xì)胞間的張力.同時，DNA發(fā)卡的序列和長度設(shè)計也可以調(diào)節(jié)力的作用大小，通過改變所連接的配體-受體對即可用該通用的探針實現(xiàn)不同細(xì)胞之間作用的機(jī)械力測量和成像.該方法與前面提到的幾種測量方法相比，不需要對細(xì)胞進(jìn)行改造，對儀器的精密度要求不高，同時細(xì)胞間的機(jī)械力可以完全通過熒光信號來轉(zhuǎn)換，無需大量的數(shù)據(jù)分析，使得測量細(xì)胞間作用力的方法更方便可靠，可用于研究力學(xué)特性在多細(xì)胞作用引起的生理和病理過程中的影響，如癌癥的產(chǎn)生和胚胎的發(fā)育等.

Fig.6 Schematic of measuring and imaging of intercellular tension[43]

3.2 體外構(gòu)建3D組織

組織在三維空間中的結(jié)構(gòu)和功能是在多細(xì)胞相互作用的基礎(chǔ)上建立的，細(xì)胞之間依賴接觸的信號交流使組織行為有序進(jìn)行，一旦細(xì)胞間的作用受到破壞就可能會導(dǎo)致正常組織的病變.研究組織結(jié)構(gòu)功能和多細(xì)胞行為的聯(lián)系有助于組織工程在生命醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.Gartner等［73］利用DNA堿基對互補(bǔ)雜交在體外自下而上重建了由細(xì)胞直接接觸作用形成的3D微組織模型，并致力賦予該組織模型功能性［圖7（A）］.如圖7（B）所示，他們［30］在此基礎(chǔ)上合成了旁分泌網(wǎng)絡(luò)信號，指導(dǎo)不同功能的細(xì)胞系層級連接構(gòu)成一個3D微組織，其中一個細(xì)胞系分泌的生長因子白介素-3（IL-3）是另一個功能模塊——未轉(zhuǎn)化的造血祖細(xì)胞系（FL 5.12）所依賴存活的分子，當(dāng)兩個細(xì)胞發(fā)生物理接觸后就能促進(jìn)FL 5.12細(xì)胞的生長.為信號刺激的免疫細(xì)胞擴(kuò)增和癌細(xì)胞在炎癥部位的富集增殖提供了體外模擬的參考，同時也有助于多細(xì)胞聚集體作為一個整體的功能應(yīng)用研究，促進(jìn)多細(xì)胞作用的疾病研究.

Fig.7 Schematic of in vitro 3D tissue construction

3.3 細(xì)胞間通訊交流

細(xì)胞間的相互作用能交換彼此之前的信息，調(diào)節(jié)生命體內(nèi)的生理和病理過程，細(xì)胞間的信息交流依靠物質(zhì)傳遞、膜接觸傳遞以及通道傳遞［74］.物質(zhì)傳遞方式依賴于分泌的化學(xué)因子作用于靶細(xì)胞以調(diào)節(jié)靶細(xì)胞下游的功能；膜接觸傳遞方式則需要細(xì)胞膜表面的識別分子識別并特異性結(jié)合鄰近的細(xì)胞，如精子和卵子的結(jié)合、T細(xì)胞和B細(xì)胞的結(jié)合等；通道傳遞是細(xì)胞間通過連接管道（連接蛋白）來傳遞信號和物質(zhì).DNA結(jié)構(gòu)功能化的細(xì)胞膜已經(jīng)被證明可以用來指導(dǎo)體外細(xì)胞聚集體的形成，同時不會對細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生影響.為了更好地了解并研究細(xì)胞間信息交流的方式，F(xiàn)an等［75］利用錨定在膜上的DNA折紙納米管道（DON）作為細(xì)胞聚集的連接分子，拉近細(xì)胞間的距離，使相同或不同種的細(xì)胞之間連接成簇，實現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞的可編程空間排列.在該設(shè)計中，DNA納米管上延伸出的DNA單鏈通過雜交連接多個細(xì)胞，形成具有不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞簇.最后，通過間隙連接［圖8（A）］、隧道納米管［圖8（B）］以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)［圖8（C）］的方式來證明了該DNA折紙納米管介導(dǎo)的細(xì)胞間可接觸交流的通訊過程.其中，細(xì)胞可以通過間隙連接實現(xiàn)相鄰細(xì)胞間分子、離子和電信號的交換，也可以通過隧道納米管來實現(xiàn)一些大分子和細(xì)胞器在細(xì)胞間的運輸.同時，通過拉近細(xì)胞與細(xì)胞之間的距離也可以實現(xiàn)T效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用.因此，基于DNA折紙納米管道作為連接兩個或以上細(xì)胞的媒介，能大大促進(jìn)細(xì)胞間通訊的研究，為研究細(xì)胞間復(fù)雜信號通路提供了通用的工具，同時也為將來DNA納米結(jié)構(gòu)工程應(yīng)用到更復(fù)雜的生理體系中奠定了基礎(chǔ).

Fig.8 Several approaches of DNA nanostructures?based cell communication[75]

Fig.9 Scheme of TLS11a and PDL1 aptamers?modified NK cells for cell immunotherapy[82]

3.4 細(xì)胞免疫治療

癌癥是當(dāng)今世界威脅人類健康的主要殺手之一，對癌癥的早期診斷和治療一直是生物醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)的研究熱點.免疫治療方式是一種人為控制（增強(qiáng)或減弱）機(jī)體免疫功能來達(dá)到治療目的的療法，其通過對自身免疫系統(tǒng)的激活和改造來增強(qiáng)自身免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用，目前已經(jīng)成為腫瘤治療的一個熱門方向［76，77］.其中，自然殺傷（NK）細(xì)胞［78，79］是一種應(yīng)用比較多的先天性免疫細(xì)胞，能夠?qū)Π┘?xì)胞產(chǎn)生天然的殺傷作用，常用于過繼細(xì)胞免疫療法中.過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移（ACT）技術(shù)是將體外培養(yǎng)的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移到病患體內(nèi)，用以抵抗和治療體內(nèi)的疾病.但是由于NK細(xì)胞表面缺乏靶向癌細(xì)胞的受體，導(dǎo)致基于NK細(xì)胞的免疫治療效率還有待提升.核酸適體已經(jīng)被證明是一種高效的分子識別工具，能夠識別癌細(xì)胞，并具有高特異性、高親和力、低免疫原性和高效的組織滲透性等優(yōu)勢.目前，已經(jīng)篩選得到免疫治療相關(guān)生物分子（如CTLA-4、PDL1適體等）的核酸適體［80，81］，將核酸適體作為人工受體錨定在免疫細(xì)胞上，有望通過細(xì)胞間的特異性作用提高腫瘤免疫治療的效率.如，2020年Tan等［82］提出采用雙核酸適體的策略標(biāo)記NK細(xì)胞（圖9），無需進(jìn)行基因?qū)用娴母脑?，就能達(dá)到腫瘤免疫治療的目的，避免了基因手段所帶來的副作用.他們選用了靶向HepG2細(xì)胞的TLS11a適體和PDL1核酸適體作為靶向分子，其中TLS11a主要負(fù)責(zé)靶向肝癌細(xì)胞，PDL1適體負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)PD1/PDL1信號通路.這一簡單設(shè)計展示出了雙功能的超級NK細(xì)胞具有過繼性免疫治療的潛力，為進(jìn)一步實現(xiàn)基于核酸適體的臨床免疫治療提供了模型.

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞間的相互作用是多細(xì)胞生物中重要的生理過程.本文對近年來基于DNA調(diào)控細(xì)胞間相互作用進(jìn)行了分類總結(jié).首先，總結(jié)了基于DNA鏈或DNA納米結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞組裝策略，分別介紹了寡核苷酸鏈雜交、受體-配體結(jié)合和核酸適體靶向識別等策略的原理及其優(yōu)缺點.其次，為了進(jìn)一步理解和思考外部刺激對細(xì)胞間相互作用的影響，介紹了pH調(diào)控、金屬離子調(diào)控和DNA鏈激活等幾種調(diào)控細(xì)胞間相互作用的外部刺激手段.最后，從測量和成像細(xì)胞間作用力、體外構(gòu)建3D聚集體、細(xì)胞通訊以及細(xì)胞免疫治療4個方面展開，系統(tǒng)總結(jié)了基于DNA納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞間相互作用研究的應(yīng)用價值，展現(xiàn)了其在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中的應(yīng)用潛力.

盡管該領(lǐng)域取得了系列進(jìn)展，基于DNA納米結(jié)構(gòu)調(diào)控細(xì)胞間相互作用的發(fā)展仍存在以下挑戰(zhàn).首先，細(xì)胞間相互作用的效率有待提高，需要尋找細(xì)胞結(jié)合效率更高的方法和設(shè)計.這一缺點主要是由于在細(xì)胞膜上錨定的人工表面受體存在易脫落、易內(nèi)化的風(fēng)險，而且DNA容易受到核酸酶的降解.雖然本文已經(jīng)提到一些增強(qiáng)表面DNA受體錨定穩(wěn)定性的方法（如引入四面體和DNA折紙作為支架），但是仍需開發(fā)出更穩(wěn)定可靠的策略來指導(dǎo)細(xì)胞間的高效率組裝.其次，生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境也會對細(xì)胞的組裝和解組裝行為產(chǎn)生影響.一方面需要借助DNA分子工具對這些外部環(huán)境的影響進(jìn)行探究，得到優(yōu)化的離子濃度、pH等環(huán)境條件下，增強(qiáng)細(xì)胞間組裝和解組裝的效率；同時，還需要探索更多內(nèi)源刺激（如蛋白）和多因素外部刺激（如光調(diào)控）手段，以進(jìn)一步豐富和理解環(huán)境對細(xì)胞間相互作用的影響.最后，基于DNA納米結(jié)構(gòu)在細(xì)胞間相互作用的應(yīng)用研究目前主要集中在模型的構(gòu)建上，還未真正應(yīng)用到更復(fù)雜的生物體系中.因此，需要進(jìn)一步拓展此領(lǐng)域的應(yīng)用范圍（尤其是在腫瘤的早期診斷和治療方面），為相關(guān)生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用研究提供新工具和新方法.