張 淼，彭金磊，劉 映，劉芳君，馬 偉，魏 華

（1.南華大學(xué)藥學(xué)院,湖南省分子靶向新藥協(xié)同創(chuàng)新中心,衡陽421001；2.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,應(yīng)用有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省有色金屬化學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州730000）

環(huán)狀結(jié)構(gòu)材料（包括環(huán)狀聚合物和環(huán)狀膠體）由于具有豐富的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和不同于線性類似物的獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而備受關(guān)注［1，2］.在相同的分子量（Mw）下，環(huán)狀聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）更高，特性黏度更低，并且熱穩(wěn)定性更高［3~8］.對于藥物控釋應(yīng)用而言，此類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的特性使其性能優(yōu)于其線性類似物，包括增強(qiáng)的膠體穩(wěn)定性、更高的細(xì)胞吸收效率和對癌細(xì)胞更高的體外細(xì)胞毒性［9~16］.目前，通過擴(kuò)環(huán)聚合和閉環(huán)反應(yīng)合成環(huán)狀聚合物的方法都存在固有的局限性.擴(kuò)環(huán)法通常需要特定的單體結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的催化劑，而閉環(huán)反應(yīng)則需要復(fù)雜的化學(xué)合成過程和高純度要求［17~21］.因此，尋找新的環(huán)狀聚合物合成方法已成為亟待解決的問題.

環(huán)糊精是一種具有獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)的天然環(huán)狀低聚糖分子，其自發(fā)現(xiàn)以來就一直備受關(guān)注［22，23］.環(huán)糊精的親水性外緣和內(nèi)部獨(dú)特的疏水空腔可以與客體分子絡(luò)合［24，25］，并且可以通過主客體識別作用構(gòu)建基于環(huán)糊精的不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，如線性、環(huán)狀、星形和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［26~28］.最近報(bào)道的以三臂星狀聚合物作為刻蝕模板，精確合成環(huán)狀膠體和環(huán)狀聚合物的研究已被證實(shí)是對目前廣泛采用的環(huán)狀聚合物的閉環(huán)反應(yīng)和擴(kuò)環(huán)聚合（REP）的有效補(bǔ)充［29］.但該模板在極稀濃度（0.3 mg/mL）的稀釋條件下才會(huì)形成作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)前體的單分子膠束.因此，開發(fā)一種以更高的濃度生產(chǎn)交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體的模板具有重要意義.

本文通過使用一種易于制備且性能良好的環(huán)狀聚合物——環(huán)狀聚甲基丙烯酸羥乙酯［c-P（HEMA）50］作為多價(jià)模板可控合成了交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體.首先通過點(diǎn)擊偶聯(lián)法，用二茂鐵（Fc）修飾c-P（HEMA）50的側(cè)鏈羥基，得到二茂鐵修飾的多價(jià)環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50，該模板可通過β-CD/Fc的主客體識別作用，在Fc位點(diǎn)有序偶聯(lián)以親水聚乙二醇（PEG）和硫辛酸（LA）功能化的β-環(huán)糊精（β-CD），形成具有明顯核殼結(jié)構(gòu)的超分子膠束；所得到的超分子膠束可進(jìn)一步通過加入催化劑量的二硫蘇糖醇（DTT）引發(fā)β-CD上修飾的LA單元的分子內(nèi)的自交聯(lián)反應(yīng)，得到交聯(lián)的超分子膠束，該交聯(lián)超分子膠束可以在1.0 mg/mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和水溶液中穩(wěn)定存在，以用于大規(guī)模制備交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體.進(jìn)一步研究了交聯(lián)超分子膠束的自組裝行為和體外抗癌藥物傳遞性能.與三臂星狀聚合物模板相比，環(huán)狀聚合物為模板的優(yōu)勢在于環(huán)狀多價(jià)結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性和空間位阻效應(yīng)，以其為模板制備的交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體的膠束前驅(qū)溶液的濃度可顯著提高至1.0 mg/mL.利用環(huán)狀多價(jià)模板制備環(huán)狀膠體的過程如Scheme 1所示.

Scheme 1 Schematic illustration of a cyclic template with multivalency for the production of ring?like colloids

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

2-溴代異丁酰溴（iBuBr，98%）、2，2′-聯(lián)吡啶（bpy，98.0%）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，99%）和三乙胺（TEA，99%），分析純，北京百靈威科技有限公司；二茂鐵甲酸（Fc-COOH）、DL-硫辛酸（LA）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，99%）、N，N，N’，N’，N”-五甲基二亞乙基三胺（PMDETA，99%）和對甲苯磺酰氯（p-TsCl，99%），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N，N-碳酰二咪唑（CDI）、聚乙二醇單甲醚（mPEG350）、二硫蘇糖醇（DTT）和溴化亞銅（CuBr，99.999%），分析純，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；β-環(huán)糊精（β-CD，96%，Mr=1134.98），分析純，梯希愛（TCI）（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，使用前需真空干燥除水；甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，99%），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用前需要通過堿性Al2O3色譜柱除去阻聚劑；疊氮化鈉（NaN3），分析純，上海三友試劑廠；無水乙醚和丙酮，分析純，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；2-異丙醇（IPA，99.0%）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯和正己烷，分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司，直接使用；無水二氯甲烷（DCM）使用前需在N2氣回流保護(hù)下重新蒸餾；透析袋（截留分子量為3500，1000和10000），西安優(yōu)博生物科技有限公司；胎牛血清和達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM），美國Gibico公司.

JEOL-ECS型核磁共振波譜儀（400 MHz，NMR），日本JEOL公司，以CDCl3和DMSO-d6作為氘代試劑；NEXUS 670型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Nicolet公司，溴化鉀壓片法，測試范圍4000~400 cm?1；DAWN EOS型體積排除色譜與多角度激光光散射聯(lián)用儀（SEC-MALLS），美國Agilent公司，使用HPLC級含0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溴化鋰的DMF為洗脫劑，測試流速1.0 mL/min，柱溫60℃；Zetasizer Nano ZS型動(dòng)態(tài)激光光散射儀（DLS），英國Malvern公司；H-7000型透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司，測試時(shí)加速電壓為100 kV；Nanite型原子力顯微鏡（AFM），瑞士Nanosurf公司；Multifuge XIR型高速離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司；Zetasizer Nano ZS型動(dòng)態(tài)激光光散射（DLS），英國Malvern公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 小分子引發(fā)劑2-溴異丁酸丙炔酯（Alkyne-Br）的制備 將重新蒸餾后的2.0 g丙炔醇和6.8 g三乙胺加入裝有50 mL無水DCM的150 mL圓底燒瓶中，冰浴攪拌30 min；將用無水DCM溶解的9.0 g 2-溴代異丁酰溴溶液緩慢滴入上述混合溶液中，待反應(yīng)液滴加完成后繼續(xù)冰浴攪拌1 h，然后將燒瓶轉(zhuǎn)移到室溫下，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h.反應(yīng)完成后對溶液進(jìn)行抽濾，收集濾液，并用蒸餾水洗滌4次，溶液用無水硫酸鈉進(jìn)行充分干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DCM，以體積比為5/1的乙酸乙酯和正己烷溶液為洗脫劑柱層析粗產(chǎn)品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，真空干燥，得到無色油狀產(chǎn)物2-溴異丁酸丙炔酯，產(chǎn)率80%.圖S1（見本文支持信息）為2-溴異丁酸丙炔酯的1H NMR圖.

1.2.2 二茂鐵甲酸丙炔酯的制備 將2.30 g（10.00 mmol）二茂鐵甲酸和2.44 g（20.00 mmol）DMAP用30 mL無水DCM充分溶解后，轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中于冰浴下攪拌；將溶有3.10 g（15.00 mmol）DCC和1.24 g（20.00 mmol）乙二醇的10 mL DCM溶液在冰浴下緩慢滴入上述圓底燒瓶中進(jìn)行反應(yīng)，滴加完成后在室溫下繼續(xù)反應(yīng)12 h；反應(yīng)完成后抽濾，將濾液濃縮后以硅膠柱純化產(chǎn)物，真空干燥后得到二茂鐵甲酸丙炔酯橙紅色固體，產(chǎn)率65%.圖S2（見本文支持信息）為二茂鐵甲酸丙炔酯的1H NMR譜圖.

1.2.3 l-P（HEMA）50-Br的制備 將0.236 mmol（48.38 mg）小分子引發(fā)劑Alkyne-Br，11.8 mmol（1.44 mL）HEMA和0.471 mmol（73.10 mg）2，2′-聯(lián)吡啶（bpy）溶于1.458 mL DMF和0.195 mL IPA的混合溶液中，待完全溶解后，將混合溶液轉(zhuǎn)移至25 mL聚合反應(yīng)管中，擰緊聚合管，進(jìn)行3次冷凍-抽氣-解凍循環(huán)后，在N2氣保護(hù)下，將0.236 mmol（33.98 mg）CuBr迅速用紙筒加入到聚合反應(yīng)管底部，繼續(xù)進(jìn)行3次冷凍-抽氣-解凍循環(huán)，封管，于65℃攪拌反應(yīng)30 min后，打開聚合管，使其與空氣接觸淬滅反應(yīng)，并加入2 mL DMF稀釋黏稠的深棕色反應(yīng)物；將該反應(yīng)物滴加至過量的冰乙醚中沉淀出粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物用少量DMF溶液溶解，并轉(zhuǎn)移至截留分子量為3500的透析袋中，用水透析48 h，每24 h換水1次，以保證產(chǎn)物中沒有殘留的銅催化劑和未反應(yīng)的單體，最后冷凍干燥透析液，得到白色固體l-P（HEMA）50-Br，產(chǎn)率87%.

1.2.4 線性前體l-P（HEMA）50-N3的制備 在裝有磁子的25 mL圓底燒瓶中分別加入800 mg l-P（HEMA）50-Br、154.94 mg NaN3和10 mL DMF，于45℃攪拌反應(yīng)48 h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)移到截留分子量為3500的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，每12 h換一次水，以去除殘留的鈉鹽；冷凍干燥，得到白色固體l-P（HEMA）50-N3，產(chǎn)率90%.

1.2.5 環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50的制備 在裝有磁子的1000 mL三頸瓶中加入450 mL DMF，接入冷凝回流裝置，緩慢升溫至100℃，向DMF中持續(xù)通入高純N2氣鼓泡除氧1 h，然后向三頸瓶中依次加入187.68μL PMDETA和128.94 mg CuBr；同時(shí)，用10 mL DMF溶解300 mg l-P（HEMA）50-N3，小流速通入N2氣鼓泡1 h以盡可能除去溶液中的氧氣；將除去氧氣的l-P（HEMA）50-N3溶液以0.4 mL/h的速度用注射泵緩慢注入CuBr/PMDETA催化體系中，注射完成后于100℃反應(yīng)24 h；反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)液冷卻至室溫后，于80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大量的DMF；然后將剩余的溶液（5 mL左右的DMF溶液）轉(zhuǎn)移到截留分子量為3500的透析袋中用水透析；透析24 h后，離心除去銅催化劑，將上清液繼續(xù)用水透析36 h；冷凍干燥得到白色絮狀產(chǎn)物c-P（HEMA）50，產(chǎn)率67%.

1.2.6 c-P（HEMA-Br）50大分子引發(fā)劑的制備 將100 mg c-P（HEMA）50溶解在4 mL無水DMF中，在冰水浴中攪拌，并持續(xù)通入N2氣；在反應(yīng)混合物中逐滴加入324μL 2-溴代異丁酰溴，滴加完成后繼續(xù)于0℃下攪拌1 h，然后在室溫下攪拌24 h；待反應(yīng)結(jié)束后用過量的冰乙醚對產(chǎn)物進(jìn)行沉淀，得到的固體沉淀物用2 mL DMF溶解，并轉(zhuǎn)移到截留分子量為3500的透析袋中用水透析48 h，每24 h換水1次；將透析液冷凍干燥，得到白色固體粉末c-P（HEMA-Br）50，產(chǎn)率95.3%.

1.2.7 環(huán)狀聚合物c-P（HEMA-N3）50的制備 將135.28 mg（0.0045 mmol）c-P（HEMA-Br）50與311.39 mg（10.06 mmol）NaN3溶于3 mL無水DMF溶液中，于45℃攪拌反應(yīng)48 h；反應(yīng)結(jié)束后，將混合反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)移到截留分子量為3500的透析袋中用水透析48 h；冷凍干燥，得到淡黃色固體粉末c-P（HEMAN3）50，產(chǎn)率88.7%.

1.2.8 環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50的制備 將20 mg c-P（HEMA-N3）50和28.51 mg二茂鐵甲酸丙炔酯溶于3 mL DMF溶液中，加入17μL配體PMDETA形成均相；將混合溶液轉(zhuǎn)移至25 mL聚合反應(yīng)管中，封管，進(jìn)行3次冷凍-抽氣-解凍循環(huán)，打開N2氣袋，用紙筒迅速將11.74 mg CuBr催化劑加入到聚合管底部，重復(fù)上述冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次；封管，在50℃油浴鍋中反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，先用冰乙醚進(jìn)行沉淀，離心，粗產(chǎn)物用THF溶解后過中性Al2O3柱子，去除未反應(yīng)完的銅催化劑，真空干燥，得到片狀黃褐色固體c-P（HEMA-Fc）50，產(chǎn)率89.6%.Scheme 2為c-P（HEMA-Fc）50的合成示意圖.

Scheme 2 Synthesis of c?P(HEMA?Fc)50

1.2.9β-CD-（mPEG350）5的制備 將2.37 gN，N-碳酰二咪唑（CDI）和2.56 g mPEG350溶于20 mL無水DCM中；將上述溶液轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中反應(yīng)24 h；補(bǔ)加10 mL無水DCM，用30 mL飽和NaCl溶液洗滌5次，每次從下層油相中收集產(chǎn)物，加入無水Na2SO4干燥4~5 h，過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用油泵將產(chǎn)物中殘留的DCM溶液抽干，將抽干的產(chǎn)物放入凍干機(jī)中繼續(xù)干燥，得到淡黃色黏稠狀液體CDI-（mPEG350）5，產(chǎn)率48%.

將639.36 mg CDI-（mPEG350）5用5 mL無水DMF溶解，加入0.5 mL TEA，轉(zhuǎn)移至25 mL圓底燒瓶中；再用2.5 mL無水DMF溶解272.4 mg干燥的CD，轉(zhuǎn)移至恒壓滴液漏斗中，緩慢滴加入圓底燒瓶中，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用無水乙醚沉淀2次，冷凍干燥，得到黏而硬的白色透明產(chǎn)物β-CD-（mPEG350）5，產(chǎn)率73.6%.

1.2.10β-CD-（mPEG350）5-LA6的制備 將215.22 mgβ-CD-（mPEG350）5、88.37 mg DCC和43.60 mg DMAP溶于4 mL無水DCM中；將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL聚合反應(yīng)管中，擰緊聚合管，進(jìn)行冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次，在N2氣保護(hù)下，于黑暗中將73.64 mg硫辛酸迅速加入聚合管底部；重復(fù)上述冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次，封管，避光冰水浴攪拌1 h后撤去冰浴，室溫避光攪拌24 h；反應(yīng)完成后過濾除去生成的N，N-二氯氨基甲酸乙酯（DCU）副產(chǎn)物，用冰乙醚沉淀2次，離心，冷凍干燥后得到黃色黏稠狀鍵合硫辛酸的親水段β-CD-（mPEG350）5-LA6，產(chǎn)率68.4%.Scheme 3為β-CD-（mPEG350）5-LA6的合成示意圖.

1.2.11 超分子膠束［c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6］的制備及交聯(lián) 用1 mL DMF溶解21.36 mg疏水段聚合物c-P（HEMA-Fc）50，然后轉(zhuǎn)移到2.64 mgβ-CD-（mPEG350）5-LA6親水段的離心管中，使其充分溶解后，通N2氣5 min，室溫下避光超聲1.5 h；將超聲后的聚合物溶液用注射泵以0.5 mL/h的速度緩慢注入到24 mL通N2氣的去離子水中，注射完成后再攪拌2 h，以確保成功形成超分子膠束；攪拌完成后，將上述聚合物水溶液直接轉(zhuǎn)移到截留分子量為10000的透析袋中，用去離子水透析24 h以除去有機(jī)溶劑DMF，將透析所得聚合物水溶液冷凍干燥，得到c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6自組裝體.

用1 mL DMF溶解21.36 mgc-P（HEMA-Fc）50疏水段聚合物，轉(zhuǎn)移到裝有2.64 mgβ-CD-（mPEG350）5-LA6親水段的離心管中，待其充分溶解后，通入N2氣5 min，室溫下避光超聲1.5 h；將超聲后的聚合物溶液用注射泵以0.5 mL/h的速度緩慢注入到10 mL通N2氣的去離子水中，注射完成后再攪拌2 h；用截留分子量為10000的透析袋用水透析2 h；補(bǔ)入14 mL去離子水，轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中，通N2氣攪拌1 h；將2.03 mg催化劑DTT（硫辛酸摩爾數(shù)的10%）用1 mL超純水溶解，用移液槍取33.84μL DTT溶液加入到上述24 mL自組裝溶液中，避光攪拌24 h；反應(yīng)結(jié)束后，直接轉(zhuǎn)移到截留分子量為10000的透析袋中用水透析24 h，冷凍干燥，得到交聯(lián)產(chǎn)物c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6（CLP）.

1.2.12 環(huán)狀核模板的刻蝕 將交聯(lián)后的3 mg聚合物溶于2 mL DMF溶液中，轉(zhuǎn)移至截留分子量為100000的透析袋中，于含有500 mL DMF的1 L燒杯中透析，加熱至50℃，以脫除環(huán)狀疏水聚合物模板，透析 72 h，每24 h更換一次DMF；有機(jī)溶劑透析結(jié)束后，將透析袋轉(zhuǎn)移至5 L去離子水中透析24 h；將透析溶液冷凍干燥，得到類環(huán)聚合物（Cyclic P），產(chǎn)率71.4%.

1.2.13 交聯(lián)載藥膠束的體外細(xì)胞毒性 將包藥后的聚合物溶于水，配成母液，逐漸稀釋為一系列濃度的聚合物樣品，將其接種在OptiMEM培養(yǎng)基上；將細(xì)胞鋪在細(xì)胞密度為2500 Cell/孔的96孔板上，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后用PBS緩沖溶液洗滌細(xì)胞；將40μL預(yù)先接種好的樣品加入到上述培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h；培養(yǎng)后的細(xì)胞用PBS緩沖溶液洗滌，并加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；在每個(gè)孔板上加入20μL MTS試劑，在上述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3 h；通過Tecan Safire 2平板讀數(shù)器測定每個(gè)孔在490 nm處的吸光度值，計(jì)算出加入上述材料后細(xì)胞的存活率.

Scheme 3 Synthesis ofβ?CD?(mPEG)5?LA6

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)狀聚合物模板c-P(HEMA-Fc)50的制備與表征

采用ATRP與點(diǎn)擊化學(xué)相結(jié)合的方法合成目標(biāo)聚合物c-P（HEMA-Fc）50.主要合成步驟如下：（i）采用ATRP技術(shù)，以Alkyne-Br引發(fā)單體HEMA聚合，制備線性聚合物l-P（HEMA）50-Br；（ii）通過線性聚合物l-P（HEMA）50-Br末端溴與疊氮基進(jìn)行親核取代反應(yīng)制備線性前體l-P（HEMA）50-N3；（iii）在極稀條件下，通過分子內(nèi)點(diǎn)擊環(huán)化線性前體l-P（HEMA）50-N3制備環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50；（iv）環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50與過量的iBuBr進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到環(huán)狀大分子引發(fā)劑c-P（HEMA-Br）50；（v）環(huán)狀大分子引發(fā)劑c-P（HEMA-Br）50與NaN3反應(yīng)，得到末端含有疊氮基的環(huán)狀聚合物c-P（HEMA-N3）50；（vi）c-P（HEMA-N3）50與二茂鐵甲酸丙炔酯進(jìn)行點(diǎn)擊耦合反應(yīng)，制備二茂鐵修飾的環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50.

首先通過ATRP技術(shù)合成了線性聚合物l-P（HEMA）50-Br，其1H NMR譜圖見圖S3（見本文支持信息）上出現(xiàn)明顯的HEMA單元的特征信號峰，根據(jù)δ4.60處與炔基相連的亞甲基質(zhì)子b峰和PHEMA與羰基相連的亞甲基質(zhì)子f峰及其側(cè)鏈末端的羥基質(zhì)子h峰的積分強(qiáng)度比，得到HEMA單元的聚合度約為50.同時(shí)圖S4（見本文支持信息）顯示l-P（HEMA）50-Br在DMF溶液中的SEC-MALLS淋洗曲線呈單峰窄分布.通過線性末端溴與NaN3進(jìn)行親核取代反應(yīng)，使l-P（HEMA）50-Br末端帶上可點(diǎn)擊的疊氮基.疊氮化后，SEC-MALLS分析表明，其SEC-MALLS淋洗曲線呈單峰分布，且整體稍微向右移動(dòng)，表明成功進(jìn)行了疊氮化反應(yīng)（見本文支持信息圖S4）.

在極稀的DMF溶液中鏈內(nèi)點(diǎn)擊環(huán)化線性前體l-P（HEMA）50-N3，成功制備了目標(biāo)聚合物環(huán)狀c-P（HEMA）50.圖S5（見本文支持信息）中δ4.60處烷基乙烯的乙烯質(zhì)子峰消失；與線性聚合物相比，環(huán)狀聚合物由于缺少鏈末端而流體力學(xué)體積較小，因此，其SEC淋洗曲線整體向右偏移（低分子量）（圖S4）；在FTIR譜圖（圖S6，見本文支持信息）中，2100 cm?1處的疊氮基特征吸收峰消失.以上結(jié)果均證實(shí)成功進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，合成了環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50.

通過酯化反應(yīng)制備了環(huán)狀大分子引發(fā)劑c-P（HEMA-Br）50.通過比較圖S5中c-P（HEMA）50和圖S7（見本文支持信息）中c-P（HEMA-Br）50的1H NMR譜圖可以發(fā)現(xiàn)，在圖S7中圖S5中δ4.79處HEMA單元的末端羥基峰消失了，同時(shí)在δ1.90處出現(xiàn)了新的信號較強(qiáng)的質(zhì)子峰a，這是發(fā)生酯化反應(yīng)后緊挨著Br的甲基的質(zhì)子峰，由此證明c-P（HEMA）50上的羥基被Br完全取代.

c-P（HEMA-Br）50的末端溴與NaN3發(fā)生親核取代反應(yīng)，疊氮化后，SEC-MALLS分析表明，其SECMALLS淋洗曲線呈單峰分布，且其SECMALLS曲線整體稍微向右移動(dòng)，表明成功進(jìn)行了疊氮化反應(yīng)（圖S8，見本文支持信息）.將c-P（HEMA-N3）50與二茂鐵甲酸丙炔酯進(jìn)行分子間點(diǎn)擊反應(yīng)制備側(cè)鏈含有二茂鐵單元的環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50.圖1給出c-P（HEMA-Fc）50的1H NMR譜圖，其中的質(zhì)子峰a，b和c為二茂鐵單元的特征質(zhì)子峰，通過計(jì)算δ1.75處的j峰與二茂鐵在δ4.3處的質(zhì)子b峰和δ5.25處的質(zhì)子c峰的積分強(qiáng)度比，得到點(diǎn)擊效率接近100%，并且圖S8中SEC-MALLS淋洗曲線明顯前移，表明點(diǎn)擊反應(yīng)是成功的.

Fig.1 1H NMR spectrum of c?P(HEMA?Fc)50 in DMSO?d6

2.2 親水段β-CD-(mPEG350)5-LA6的制備與表征

通過CDI與單體mPEG350進(jìn)行酯化反應(yīng)得到β-CD-（mPEG350）5；再進(jìn)一步通過DCC縮合反應(yīng)，利用環(huán)糊精多羥基位點(diǎn)與硫辛酸（LA）功能化的環(huán)糊精制備β-CD-（mPEG350）5-LA6.

通過酯化反應(yīng)得到CDI-（mPEG350）5，其1H NMR譜如圖S9（見本文支持信息）所示，由δ3.3處mPEG350鏈末端的甲基質(zhì)子a峰及與CDI相連的酯基旁邊的亞甲基質(zhì)子b峰積分面積得到mPEG350的聚合度為5，同時(shí)在δ8.2，7.5和7.2處分別出現(xiàn)CDI的特征氫峰（e，c和d峰）.

通過環(huán)糊精與硫辛酸進(jìn)行DCC縮合反應(yīng)制備親水段，其1H NMR譜如圖2所示，根據(jù)mPEG350鏈末端的甲基質(zhì)子a峰與硫辛酸的特征氫b，c和d峰的積分面積比，計(jì)算得到硫辛酸的鍵合數(shù)為6.圖3給出了所制備的兩親性聚合物［c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6］的SEC-MALLS淋洗曲線.所有制備的聚合物的分子參數(shù)列于表1.

Fig.2 1H NMR spectrum ofβ?CD?(mPEG)5?LA6 in CDCl3

Fig.3 SEC?MALLS elution traces ofβ?CD?(mPEG)5?LA6,c?P(HEMA?Fc)50,cross linking P(CLP)and cyclic P using DMF as an eluent

Table 1 Summary of molecular parameters of all the synthesized polymers

Fig.4 2D NOESY NMR spectra of c?P(HEMA?Fc)50 andβ?CD?(mPEG350)5 in DMSO?d6

2.3 超分子膠束的制備與表征

將親疏水段聚合物溶于有機(jī)溶劑DMF中，超聲30 min后將其緩慢注射到大量超純水中，得到均相且澄清透明的聚合物溶液.圖4給出β-CD-（mPEG350）5和c-P（HEMA-Fc）50的二維NOESY譜圖，證明成功制備了β-CD/Fc主-客體包合物.紫色圓圈中突出的交叉峰歸屬于β-CD質(zhì)子在δ3.25~3.60范圍內(nèi)的特征吸收峰與Fc在δ4.20~4.50范圍內(nèi)的共振吸收峰之間的偶極相互作用.環(huán)狀核模板的多價(jià)結(jié)構(gòu)使所制備的超分子核-殼膠束比先前報(bào)道的基于三臂星形聚合物模板的膠束前體具有更高的穩(wěn)定性和空間位阻，從而顯著提高了制備交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體的濃度（1.0 mg/mL，先前使用的環(huán)狀膠體的濃度為0.3 mg/mL）.在37℃，聚合物濃度為1.0 mg/mL時(shí)通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測得c-P（HEMA-Fc）50與β-CD-（mPEG350）5-LA6自組裝膠束的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑為142.6 nm（圖5）.根據(jù)SEC-MALLS測 定 的c-P（HEMA-Fc）50（63.7 nm）和β-CD-（mPEG350）5-LA6（20.3 nm）的Rg值（表1），超分子膠束的直徑約為100 nm，與DLS數(shù)據(jù)吻合較好.該超分子膠束具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，其在0.03~1.0 mg/mL的各種稀釋濃度幾乎保持相同的流體力學(xué)尺寸和尺寸分布，這歸因于環(huán)狀聚合物作為模板時(shí)可能處于具有更大穩(wěn)定性和空間位阻的多價(jià)結(jié)構(gòu)中，從而導(dǎo)致制備環(huán)狀材料的膠體濃度顯著增加.同時(shí)，該膠束在水相和DMF相的流體力學(xué)體積表現(xiàn)出幾乎相同的尺寸及尺寸分布［圖6（A）］.以上結(jié)果證實(shí)，環(huán)狀聚合物作為多價(jià)核心模板具有更大的穩(wěn)定性和空間位阻性，有利于環(huán)類膠體和環(huán)狀聚合物的大規(guī)模生產(chǎn).

Fig.5 Mean hydrodynamic size and size distribution of P micelles at various concentrations ranging from 0.03 mg/mL to 1.2 mg/mL

Fig.6 Mean hydrodynamic size and size distribution of P micelles in water and DMF at a polymer concentration of 1.0 mg/mL(A)and NCLP,CLP and Cyclic P micelles in a polymer concen?tration of 1.0 mg/mL(B)

2.4 DTT催化的交聯(lián)膠束的制備與表征

向c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-PEG-LA的超分子膠束中進(jìn)一步加入催化劑量的二硫蘇糖醇（DTT），引發(fā)β-CD上修飾的LA單元的分子內(nèi)的自交聯(lián)反應(yīng)，得到交聯(lián)的超分子膠束（CLP），作為下一步環(huán)狀結(jié)構(gòu)的刻蝕模板.臨界膠束濃度對于制備CL膠束前體至關(guān)重要，一方面，該濃度應(yīng)足夠低，以確保僅發(fā)生膠束內(nèi)交聯(lián)而沒有任何膠束間反應(yīng)的發(fā)生；另一方面，該濃度也應(yīng)該足夠高，以允許以適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率大規(guī)模生產(chǎn)環(huán)狀膠體.由于使用的環(huán)狀核模板具有多價(jià)性、穩(wěn)定性和增強(qiáng)的空間位阻，本文制備環(huán)狀膠體的前體濃度（1.0 mg/mL）明顯高于以三臂星狀聚合物作為模板時(shí)的濃度（0.3 mg/mL）.圖6（B）中未交聯(lián)超分子膠束（NCLP）和交聯(lián)超分子膠束幾乎一致的流體力學(xué)直徑表明在此關(guān)鍵制劑濃度下的膠束內(nèi)交聯(lián)占主導(dǎo)地位.利用SEC-MALLS進(jìn)行脫核后的表征，選擇DMF為洗脫劑，柱子的溫度為60℃.可以發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)后SEC洗脫曲線明顯前移，并且出現(xiàn)兩個(gè)SEC洗脫峰，其保留時(shí)間分別為16 min及20 min左右（圖3）.根據(jù)先前的文獻(xiàn)報(bào)道，DMF是親疏水段的良溶劑，當(dāng)在較高溫度（50℃）時(shí)，環(huán)糊精會(huì)與客體分子之間發(fā)生解組裝［29］，因此出現(xiàn)的雙峰中具有較短保留時(shí)間的主峰就合理地歸屬為親水段交聯(lián)后脫去環(huán)狀模板c-P（HEMA-Fc）50的洗脫峰，并且其保留時(shí)間與c-P（HEMA-Fc）50相符合.另外環(huán)狀聚合物的SEC-MALLS洗脫峰向較短的洗脫時(shí)間明顯轉(zhuǎn)移，通過計(jì)算，環(huán)狀P的Mn（Mn=350100）約是單個(gè)親水段β-CD-（mPEG350）5-LA6（Mn=7100）的50倍（表1），這一結(jié)果證明通過基于P膠束的充分交聯(lián)成功地形成了包含50個(gè)β-CD-（mPEG350）5-LA6親水段的環(huán)狀膠體.上述結(jié)果證實(shí)了使用DMF和相對較高的溫度來刻蝕環(huán)狀核模板c-P（HEMA-Fc）50的可行性.

2.5 環(huán)狀聚合物和類環(huán)膠體的制備與表征

在較高溫度（50℃）下的DMF溶液中，通過破壞環(huán)糊精與客體分子二茂鐵之間的相互作用力，刻蝕掉環(huán)狀核模板c-P（HEMA-Fc）50.當(dāng)膠束解組裝后，通過親疏水段聚合物分子量的差異，選擇合適分子量的透析袋（100000）選擇性分離c-P（HEMA-Fc）50，最后得到完全由環(huán)糊精構(gòu)建的環(huán)狀聚合物.脫核后SEC-MALLS淋洗曲線呈現(xiàn)的單峰表明疏水環(huán)狀聚合物核模板已被脫除，成功制備了環(huán)狀聚合物或類環(huán)膠體.通過DLS測試得到交聯(lián)前c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG）5-LA6液體力學(xué)粒徑為142.6 nm，交聯(lián)后為137.1 nm，脫掉環(huán)狀模板后為214.2 nm.

透射電子顯微鏡（TEM）測量可以直觀地觀察每個(gè)階段聚合物的形態(tài)變化.未交聯(lián)超分子膠束（NCLP）和交聯(lián)超分子膠束（CLP）均形成大小相似且分散均勻的球形納米顆粒，其平均直徑約為35 nm［圖7（A）和（B）］，這也證實(shí)了交聯(lián)僅發(fā)生在膠束內(nèi)，而未發(fā)生任何膠束間反應(yīng).當(dāng)刻蝕掉環(huán)狀核模板c-P（HEMA-Fc）50后，TEM圖像顯示出明顯的形態(tài)轉(zhuǎn)變，其納米粒子的大小已增加到大約45 nm［圖7（C）］.這種尺寸變化說明疏水內(nèi)核的去除促使親水部分溶脹，這與DLS結(jié)果非常吻合［圖6（B）］.圖7（D）給出環(huán)狀聚合物的AFM照片，圖中清晰而均勻的環(huán)有力地證實(shí)了環(huán)狀內(nèi)核的刻蝕及成功生成環(huán)狀聚合物.類環(huán)狀聚合物的平均大小約為42 nm，這與TEM分析結(jié)果吻合.與TEM數(shù)據(jù)相比，類環(huán)狀聚合物膠束在DLS下的平均尺寸略大，這可能是由于環(huán)狀聚合物的狀態(tài)不同，即用于TEM觀測的為脫水狀態(tài)而用于DLS測量的為水合狀態(tài)［30］.

Fig.7 TEMimages of NCLP(A),CLP(B)and Cyclic P(C)and AFMimage of Cyclic P(D)

2.6 交聯(lián)載藥膠束的體外細(xì)胞毒性

在人肝癌細(xì)胞HepG2中，通過MTS法評估了空白和負(fù)載抗癌藥物阿霉素（DOX）的交聯(lián)膠束的體外細(xì)胞毒性.由圖8可見，即使在濃度高達(dá)0.48 mg/mL時(shí)，空白膠束對HepG2細(xì)胞仍表現(xiàn)為不抑制，細(xì)胞存活率高于80%，結(jié)果表明空白聚合物膠束對肝癌細(xì)胞基本無毒，具有良好的生物相容性.

同時(shí)，我們考察了負(fù)載DOX的交聯(lián)膠束的體外細(xì)胞毒性.經(jīng)GraphPad Prism 6軟件計(jì)算得到自由DOX和載藥交聯(lián)膠束的IC50（即細(xì)胞存活率為50%對應(yīng)的藥物濃度）值分別為1.09（置信區(qū)間為0.87~1.32）和70.81（置信區(qū)間為60.50~81.11）μg/mL.載藥交聯(lián)膠束的體外細(xì)胞毒性［圖9（A）］明顯低于自由DOX［圖9（B）］，這可能是因?yàn)樽杂蒁OX具有直接的膜滲透機(jī)制，而載藥交聯(lián)膠束是通過較慢的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的，同時(shí)相對于直接在胞內(nèi)發(fā)揮藥效的小分子DOX，載藥膠束在胞內(nèi)是通過藥物釋放動(dòng)力學(xué)來實(shí)現(xiàn)藥物的釋放，說明本文制備的聚合物在藥物控釋與癌癥治療領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力［31］.

Fig.9 In vitro cytotoxicity of HepG2 cells incubated for 24 h with DOX?loaded CLP micelles(A)and free DOX(B)

3 結(jié) 論

使用一種易制備且性能良好的環(huán)狀聚合物——環(huán)狀聚甲基丙烯酸羥乙酯［c-P（HEMA）50］作為生產(chǎn)相對較高濃度的環(huán)狀膠體的新型模板.該環(huán)狀聚合物模板具有更高的穩(wěn)定性和空間位阻的多價(jià)結(jié)構(gòu)，其制備交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體膠束的前驅(qū)溶液的濃度可顯著提高至1.0 mg/mL.本文不僅發(fā)展了簡單高效的制備環(huán)狀聚合物的新策略，并且所開發(fā)的具有聚二硫鍵的還原敏感性交聯(lián)膠束和環(huán)狀膠體在控釋應(yīng)用中具有巨大潛力.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210370.