張 樂(lè)，陳如意，李玉雙，郭志平

（麗水學(xué)院，a.醫(yī)學(xué)院；b.生態(tài)學(xué)院；c.醫(yī)務(wù)室，浙江 麗水 323000）

ERECTA 是一種富含亮氨酸重復(fù)序列的類(lèi)受體蛋白激酶，廣泛分布于各種植物的器官和組織［1］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）ERECTA基因參與花藥發(fā)育，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化［2］，ERECTA基因還與植株抗逆性相關(guān)，其過(guò)表達(dá)能夠提高植株對(duì)高溫干旱的耐受性［3，4］。目前，僅在少數(shù)經(jīng)濟(jì)作物上有EREC?TA基因相關(guān)的研究［5-7］。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）在世界各地廣泛種植，因其具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，已成為世界第三大淀粉原料作物和第四大糧食作物［8］。馬鈴薯除菜用外，近年來(lái)，利用馬鈴薯生產(chǎn)薯片、薯?xiàng)l、淀粉等的產(chǎn)量不斷增加。為滿足不同需求，育種工作者根據(jù)不同區(qū)域的氣候特點(diǎn)和生產(chǎn)用途，在利用傳統(tǒng)方法積極開(kāi)展馬鈴薯種質(zhì)資源研究和雜交育種的同時(shí)，積極探索利用現(xiàn)代生物技術(shù)在分子水平開(kāi)展種質(zhì)資源研究和分子標(biāo)記育種，目前已取得了一定的成果［9］。本研究通過(guò)RT-PCR 技術(shù)克隆馬鈴薯ERECTA基因cDNA 序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步開(kāi)展該基因的功能研究和馬鈴薯分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為浙江省麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的克新19 馬鈴薯（種質(zhì)來(lái)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院克山分院）。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 總RNA 的提取參照李飛等［10］的方法，取新鮮馬鈴薯幼苗嫩葉置于預(yù)冷的研缽中，同時(shí)加入Trizol 試劑，充分研磨并振蕩混勻，放置5 min，離心10 min 后取上清液；添加氯仿混勻，室溫下放置3 min，離心15 min 取上清液；換至新離心管中，按1 mL Trizol 加0.5 mL 異丙醇的比例配比，靜置后離心10 min，棄上清液；按1 mL Trizol 液加入1 mL 以上的75% 乙醇清洗沉淀，渦旋振蕩混勻，離心5 min，沉淀在室溫下干燥5~10 min，然后將總RNA 溶于DEPC 水。 以提取得到的總RNA 為模板，采用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 馬鈴薯ERECTA基因cDNA 克隆 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取馬鈴薯ERECTA基因cDNA 序列（NCBI登陸號(hào)：XM_006353788），設(shè)計(jì)上游引物：5′-TCAAAGGAGCTGAGTTAGTGCA-3′；下游引物：5′-TCAGCATCAGTGGTCCCAAA-3′。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，割膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司檢測(cè)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）將馬鈴薯ERECTA基因的cDNA 翻譯成氨基酸序列。使用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等理化性質(zhì)，并通過(guò)ProP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProP-1.0/）分析馬鈴薯ERECTA蛋白中有無(wú)信號(hào)肽、前導(dǎo)肽。利用MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1 000 次Bootstrap。 用SWISS-MODLE（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)馬鈴薯ERECTA 蛋白進(jìn)行三維建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯ERECTA 基因cDNA 克隆

利用Trizol 試劑從馬鈴薯幼苗嫩葉中提取到了總RNA，經(jīng)Nanodrop 和瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA濃度和質(zhì)量（圖1A）。隨后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 第一鏈，并利用Taq酶體外擴(kuò)增ERECTA基因cDNA，電泳檢測(cè)條帶大小為3 281 bp，與預(yù)期一致（圖1B）。

圖1 馬鈴薯ERECTA 基因cDNA 克隆

2.2 馬鈴薯ERECTA 蛋白分子特征

馬鈴薯ERECTA基因cDNA 序列包括一個(gè)2 973 bp 的開(kāi)放閱讀框，可編碼990 個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)分析馬鈴薯ERECTA 蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示該蛋白的分子質(zhì)量為108.95 kDa，理論等電點(diǎn)為5.85。馬鈴薯ERECTA 蛋白具有一個(gè)信號(hào)肽，信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于32 位和33 位氨基酸之間；馬鈴薯ERECTA不含前導(dǎo)肽（圖2）。

圖2 馬鈴薯ERECTA 蛋白信號(hào)肽和前導(dǎo)肽預(yù)測(cè)

2.3 ERECTA 氨基酸序列對(duì)比

多序列比對(duì)結(jié)果表明，馬鈴薯ERECTA 蛋白的氨基酸序列中含有10 個(gè)保守基序，其中8 個(gè)為富含亮氨酸的LRR 基序，它們由長(zhǎng)度為8~45 的氨基酸殘基組成，通常折疊成弧形或馬蹄形；ERECTA 有1 個(gè)Pkinase 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是具有催化功能的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖3 馬鈴薯ERECTA 及其同源序列的多重比對(duì)

2.4 同源性分析

序列同源性分析表明，馬鈴薯ERECTA與辣椒（Capsicum annuum）ERECTA的 一 致 性 最 高（94.04%），其次是與煙草（Nicotiana tabacum）ERECTA的一致性（93.65%）較高，與黃花風(fēng)鈴木（Handroanthus impetiginosus）ERECTA 的一致性最低（85.03%）。這與多序列比對(duì)的結(jié)果一致（表1）。

表1 馬鈴薯ERECTA 與其他植物ERECTA 一致性分析

2.5 ERECTA 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了分析馬鈴薯ERECTA 與其他植物ERECTA之間的親緣關(guān)系，利用MEGA 軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，馬鈴薯ERECTA 與智利番茄、芝麻ERECTA 聚為一簇，進(jìn)而和小?？Х染蹫橐淮?，說(shuō)明馬鈴薯ERECTA 在進(jìn)化上的保守性（圖4）。

圖4 馬鈴薯ERECTA 與其他植物ERECTA 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.6 馬鈴薯ERECTA 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

馬鈴薯ERECTA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)含34.9% 的α-螺旋，50.9% 的無(wú)規(guī)則卷曲，14.2% 的β-折疊。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，馬鈴薯ERECTA 包含8 個(gè)富含亮氨酸的LRR 基序（圖5）。

3 討論

ERECTA基因?qū)χ仓晟L(zhǎng)發(fā)育有多個(gè)方面作用，如控制植株的矮化過(guò)程［11］。對(duì)擬南芥的研究表明，ERETCA 通過(guò)調(diào)控分生組織的細(xì)胞分裂周期實(shí)現(xiàn)植株矮化［12，13］。ERECTA基因家族還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制氣孔分化，從而促進(jìn)植物葉片的伸長(zhǎng)［14］。相關(guān)研究表明，ERETCA基因與植物抗逆性也密切相關(guān)，能夠提高植物對(duì)高溫干旱的耐受性［15］。例如高粱（Sorghum bicolor）ERECTA1和ERECTA2基因均在高粱莖和葉中表達(dá)，而且其表達(dá)水平均隨著干旱脅迫程度的加深而逐漸提高［15］。因此，進(jìn)一步研究ERECTA基因在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，對(duì)馬鈴薯種質(zhì)研究和育種有指導(dǎo)意義。

馬鈴薯ERECTA蛋白分子的質(zhì)量為108.95 kDa，這與Shen 等［3］研究的擬南芥ERECTA 分子質(zhì)量有所不同，但與辣椒ERECTA 的分子質(zhì)量相近。通過(guò)多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，馬鈴薯與辣椒等的親緣關(guān)系較近，但與擬南芥的關(guān)系較遠(yuǎn)。研究同時(shí)表明，馬鈴薯ERECTA 與擬南芥ERECTA 在結(jié)構(gòu)和功能上有所差異［7］。ERECTA 為編碼富含亮氨酸重復(fù)序列的類(lèi)受體蛋白激酶（LRR-RLK），LRR-RLKs是普遍存在于植物中的信號(hào)受體亞家族，它們調(diào)控多種信號(hào)通路［15］。馬鈴薯ERECTA 蛋白同樣擁有8個(gè)LRR 保守基序以及1 個(gè)激酶構(gòu)域，這些保守度較高的基序在其他植物ERECTA 蛋白中也存在［15，16］。馬鈴薯ERECTA基因的克隆和生物信息學(xué)分析，為后續(xù)的功能研究和分子育種奠定了基礎(chǔ)。