莫宏輝，鄧國衛(wèi)，李 珊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；2.湖南中和制藥有限公司，長沙 410205）

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millet?tia speciosaChamp.），以根入藥，屬于藥食同源品種之一，具有補虛潤肺、強筋活絡(luò)等功效，中醫(yī)臨床上常用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺虛咳嗽、慢性支氣管炎等［1］。據(jù)已有的研究報道發(fā)現(xiàn)，牛大力中存在多糖類、三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類、微量元素、氨基酸等多種不同類型成分［2，3］，具有提高免疫、抗疲勞、抗應(yīng)激、保肝、祛痰、止咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［4，5］。

牛大力葉是來源于美麗崖豆藤的葉子，全年可采收，目前有關(guān)牛大力葉的研究報道主要集中于專利方面，如“一種牛大力葉或/和花保健茶及其加工方法”“一種牛大力葉茶及其制備方法”等［6，7］，而對其化學(xué)成分、藥理活性、提取純化工藝等則未見報道。目前，國家衛(wèi)生健康委員會已批準(zhǔn)牛大力作為新食品原料，但在促進該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時也引發(fā)了原材料價格上漲，如能對其葉子資源進行開發(fā)利用，將有望借鑒于枇杷葉、三七花、三七莖葉、白木香葉等作為地方特色食品成為新食品原料［8］。因此，本研究對牛大力葉中的總多糖、總黃酮、總皂苷等成分含量進行測定，同時對其體外抗氧化活性進行評價，以期為其資源的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)，也進一步填補相關(guān)研究的空白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥D-無水葡萄糖對照品（含量98%，CAS號：50-99-7，成都埃法生物科技有限公司）；蘆丁對照品（含量98 %，CAS 號：153-18-4，成都埃法生物科技有限公司）；人參皂苷Rb1 對照品（含量98%，CAS 號：41753-43-9，成都埃法生物科技有限公司）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、香草醛、水楊酸、冰醋酸、高氯酸、鄰苯三酚、苯酚、濃硫酸、鹽酸、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等均為分析純。

牛大力鮮葉由湖南中和制藥有限公司提供，批次分別為01、02、03，每批次2 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李珊副主任藥師鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia speciosaChamp.）的葉子。1.1.2 儀器 UV-1700 雙光束紫外分光光度計（日本島津）；BP-211D 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；FreeZone2.5 冷凍干燥機（美國LABCONCO）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛大力葉提取物制備［9］將不同批次牛大力葉置于烘箱60 ℃烘干，粉碎成粗粉，準(zhǔn)確稱取100 g，第一次加入20倍量水，浸泡0.5 h，加熱回流提取2 h，提取液離心，取上清液；第二次加入15 倍量水，加熱回流提取2 h，提取液離心，取上清液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中75 ℃減壓濃縮至適宜濃度，真空冷凍干燥后粉碎過100 目篩，測得固形物得率分別為：01 批次，16.8%；02 批次，17.3%；03 批次，16.2%。

1.2.2 總多糖的含量測定［3，10］

1）溶液的配制。精密稱取D-無水葡萄糖對照品10.25 mg 于100 mL 容量瓶中，加去離子水定容，配制102.5 μg/mL 的對照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物50.13 mg 于100 mL 容量瓶中，加去離子水定容，配制501.3 μg/mL 的供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取102.5 μg/mL 的D-無水葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到試管中，依次加入水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL，再分別加入5% 苯酚溶液1.0 mL 和濃硫酸溶液5.0 mL，80 ℃水浴20 min，取適量混合液于分光光度計中490 nm 處測定吸光值。以D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為X、吸光度值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程：Y=0.084 0X+0.031 7（R2=0.996 8），結(jié)果顯示，在2.56~12.81 μg/mL，吸光值具有良好的線性關(guān)系。

3）方法學(xué)考察。參考文獻［3］和［10］操作，測得精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗、加樣回收率試驗的RSD分別為1.03%、0.82%、0.59%、1.06%，表明該方法及儀器均符合要求（回收率具體數(shù)據(jù)見表1）。

4）總多糖含量測定。按照以上試驗操作步驟同法測定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光值，計算總多糖含量。

1.2.3 總黃酮的含量測定［3，11］

1）溶液的配制。精密稱取蘆丁對照品9.80 mg于10 mL 容量瓶中，加60% 乙醇定容，配制0.98 mg/mL的對照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物100.13 mg 于10 mL 容量瓶中，加60% 乙醇定容，配制10.013 mg/mL 的供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.98 mg/mL 的蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到試管中，各加入0.5 mL 的5% 亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加入0.5 mL 的5% 硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，然后加入4.0 mL 的4% 氫氧化鈉溶液，最后加入60% 乙醇定容至10 mL，靜置15 min，取適量混合液于分光光度計中510 nm 處測定吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為X、吸光值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：Y=0.008 2X+0.020 5（R2=0.998 8），結(jié)果顯示，在19.60~98.0 μg/mL，吸光值具有良好的線性關(guān)系。

3）方法學(xué)考察。參考文獻［3］和［11］操作，測得精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗、加樣回收率試驗的RSD分別為1.10%、2.41%、1.98%、1.03%，表明該方法及儀器均符合要求（回收率具體數(shù)據(jù)見表2）。

4）總黃酮含量測定。按照以上試驗操作步驟同法測定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光度值，計算總黃酮含量。

1.2.4 總皂苷的含量測定［3，12］

1）溶液的配制。精密稱取人參皂苷Rb1 對照品8.20 mg 于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制0.82 mg/mL 的對照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物150.24 mg 于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制15.024 mg/mL 的供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.82 mg/mL 的人參皂苷Rb1 對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到試管中，水浴蒸干后加入0.2 mL 的5 %香草醛冰醋酸試液和0.8 mL 高氯酸，60 ℃水浴20 min，取出加入5.0 mL 冰醋酸，混勻后取適量混合液于分光光度計中540 nm 波長處測定吸光度值，以人參皂苷Rb1 質(zhì)量濃度為X、吸光值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：Y=0.003 8X+0.160 4（R2＝0.999 1），結(jié)果顯示，在27.0~135.0 μg/mL，吸光值具有良好的線性關(guān)系。

3）方法學(xué)考察。參考文獻［3］和［12］操作，測得精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗、加樣回收率試驗的RSD分別為0.67%、3.95%、4.27%、3.16%，表明該方法及儀器均符合要求（回收率具體數(shù)據(jù)見表3）。

4）總皂苷含量測定。按照以上試驗操作步驟同法測定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光度值，計算總皂苷含量。

1.2.5 清除DPPH·能力測定 參考文獻［13］，分別吸取2 mL 的01 批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液（5.0~30.0 mg/mL）、1.0 mL 0.35 mg/mL 的DPPH儲備液加入到試管中，反應(yīng)30 min 后取適量混合液于分光光度計中517 nm 處測定吸光值A(chǔ)m；另吸取2 mL 水和1 mL 的DPPH 儲備液，同法反應(yīng)后測定吸光值A(chǔ)0；另吸取牛大力葉提取物溶液2 mL 和無水乙醇1.0 mL，同法反應(yīng)后測定吸光值A(chǔ)n。根據(jù)公式計算其清除率：

1.2.6 清除ABTS+·能力測定 參考文獻［13］，按照體積比2∶1，分別吸取7 mmol/L 的ABTS 溶液和7.35 mmol/L 的過硫酸鉀溶液適量進行混合，避光反應(yīng)16 h，再用水稀釋，取適量混合液于分光光度計中734 nm 處測定，調(diào)節(jié)至吸光值A(chǔ)0為0.70±0.2。再分別吸取01 批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液（1.0~10.0 mg/mL）2 mL 和ABTS 稀釋液4 mL 加入試管中，超聲30 s，靜置反應(yīng)8 min 后同法測定吸光值A(chǔ)1。根據(jù)公式計算其清除率：

1.2.7 清除·OH 能力測定 參考文獻［13］，吸取01批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液（4.0~14.0 mg/mL）、6 mmol/L 的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液各2 mL 加入到試管中，反應(yīng)10 min 后加入6 mmol/L 的水楊酸溶液2 mL，反應(yīng)30 min，取適量混合液于分光光度計中510 nm 處測定吸光值A(chǔ)1；以水代替水楊酸溶液，同法操作后測定吸光值A(chǔ)2；另外以純水作為空白對照，同法操作后測定吸光值A(chǔ)0。根據(jù)公式計算其清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3 種不同類型成分測定方法的加樣回收率試驗數(shù)據(jù)見表1（樣品取樣量為501.30 μg，樣品中多糖量為40.60 μg，加入對照品量為41.00 μg）、表2（樣品取樣量為10 013.00 μg，樣品中黃酮量為360.98 μg，加入對照品量為343.00 μg）和表3（樣品取樣量為15 024.00 μg，樣品中皂苷量為137.79 μg，加入對照品量為123.00 μg），結(jié)果均表明所用方法的準(zhǔn)確性良好，能夠有效進行含量測定。

表1 牛大力葉提取物總多糖加樣回收率測定結(jié)果（n=6）

表2 牛大力葉提取物總黃酮加樣回收率測定結(jié)果（n=6）

表3 牛大力葉提取物總皂苷回收率測定結(jié)果（n=6）

2.2 不同類型成分含量的測定

由試驗分別測得牛大力葉提取物中總多糖、總黃酮、總皂苷的含量依次為（1.36±0.05）% 、（0.61±0.007）%、（0.15±0.013）%，其中以總多糖含量最高、總皂苷含量最低，結(jié)果見表4。

表4 牛大力葉提取物中不同類型成分的含量（n=3）（單位：%）

2.3 體外抗氧化能力評價

由試驗分別測得牛大力葉提取物對不同自由基清除能力變化趨勢的線性回歸方程及IC50，其中IC50由小到大依次為ABTS+·、O-2·、·OH、DPPH·，結(jié)果見表5、圖1。

表5 牛大力葉提取物對不同自由基的清除能力

圖1 不同濃度牛大力葉提取物對不同自由基的清除率

3 小結(jié)

試驗通過水提法制備牛大力葉提取物，以化學(xué)顯色法及分光光度法測定不同類型成分的含量，發(fā)現(xiàn)其含量高低排序為總多糖>總黃酮>總皂苷，這與其牛大力根所測得成分含量高低趨勢基本一致［3］，說明同株植物不同部位的成分類型及含量高低具有一定的相似性。同時，體外抗氧化試驗結(jié)果顯示，牛大力葉提取物對ABTS+·的抗氧化能力最強，而對DPPH·的清除能力則最弱。與已報道的相比，與黃精多糖等效果接近而比白芷多糖、合歡皮多糖、車前子多糖等更強［14］。

因此，可在此牛大力葉提取物的基礎(chǔ)上，進一步利用醇沉、柱層析、有機溶劑萃取等方法進行純化、分離、富集，以獲得成分純度和含量更高、抗氧化活性更強的物質(zhì)，為牛大力葉的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)依據(jù)。有關(guān)抗氧化作用強弱與不同類型成分間的相關(guān)性，將在進一步的試驗中展開研究。