盛 云 許 靜

1.江蘇省盱眙縣盱城街道綜合服務(wù)中心，江蘇盱眙 211700；2.江蘇省盱眙縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇盱眙 211700

在養(yǎng)羊生產(chǎn)中使用人工授精技術(shù)可以大大提高種公羊的利用效率，防止一些疾病的傳播、提高受胎率和減少一定的養(yǎng)殖成本等[1-3]。因?yàn)榫d羊精液保存技術(shù)的缺乏，實(shí)際生產(chǎn)中大多采用新鮮精液進(jìn)行輸精，受時(shí)間和區(qū)域的限制不能充分發(fā)揮人工授精技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。人工授精技術(shù)的核心是精液有效保存時(shí)間的延長(zhǎng)，而影響精液保存時(shí)間的因素之一是稀釋液成分的選擇[4-5]。稀釋液是由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、緩沖物質(zhì)和抗菌物質(zhì)組成，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在其中的作用至關(guān)重要，糖類物質(zhì)是最主要也最常使用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，精子可以利用稀釋液中的糖類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為其運(yùn)動(dòng)和存活提供能量[6]。精液常溫保存過程需要消耗一定的糖類，因此，在稀釋液中必須添加適宜濃度的糖類，低濃度的糖不能滿足精液保存過程中的消耗，縮短精子的有效存活時(shí)間，而過高濃度的糖則會(huì)影響稀釋液的滲透壓，破壞精子的結(jié)構(gòu)，從而影響精液的保存品質(zhì)[7]。另一方面果糖在人精漿中含量較高，對(duì)精子具有一定的保護(hù)作用，但在精液體外保存中添加果糖的研究較少[8]。因此，為探究糖類添加量對(duì)綿羊精液常溫保存的影響，本研究在稀釋液中添加不同濃度的果糖，通過檢測(cè)精子活率、活力和直線速率等精子運(yùn)動(dòng)性能來確定稀釋液中最適宜的果糖添加量，以提高精液的保存品質(zhì)、延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間，從而提高人工授精技術(shù)的受胎率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）試驗(yàn)動(dòng)物：本試驗(yàn)所用精液采自于江蘇綠森然有限公司提供的3 只健康湖羊，年齡為2 歲，膘情優(yōu)良，體質(zhì)健壯，無任何疾病。

2）主要儀器設(shè)備：邁朗全自動(dòng)精子分析儀、恒溫水浴鍋、電子分析天平、渦旋振蕩器和恒溫箱。

3）主要試劑與藥品：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、果糖、檸檬酸、青霉素鈉和硫酸鏈霉素。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用含有0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 g/mL 果糖的綿羊精液常溫保存稀釋液對(duì)綿羊精液進(jìn)行15 ℃常溫保存，每隔24 h 輕輕翻動(dòng)精液，防止精子沉淀聚積。在精液保存期間，每天采用CASA 對(duì)精子活率、活力、直線速率、曲線速率、路徑速率、移動(dòng)角度和側(cè)擺幅度進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)不同濃度的果糖對(duì)綿羊精液常溫保存的作用效果。

1.3 試驗(yàn)方法

1）稀釋液配置：使用電子天平準(zhǔn)確稱取0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 g 果糖，1.23 g Tris，0.66 g 檸檬酸，0.01 g 青霉素鈉和0.03 g 硫酸鏈霉素，分別充分溶解于40.00 mL 滅菌的超純水，配置成含有0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 g/mL 果糖的綿羊精液常溫保存稀釋液。

2）精液采集與稀釋：采用假陰道法采集公羊精液，采精結(jié)束后，將精液置于37 ℃保溫杯并在30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查，選取顏色、氣味和射精量正常的精液鏡檢，選取精子活力80%以上、畸形率低于15%的精液進(jìn)行混勻處理，采用預(yù)熱的含有不同濃度果糖的稀釋液進(jìn)行稀釋，然后用多層棉花包裹置于15 ℃恒溫箱保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。每組設(shè)置有3個(gè)重復(fù)，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 在常溫保存下不同質(zhì)量濃度果糖對(duì)綿羊精子活率的影響

由表1可知，添加適宜濃度的果糖可以提高綿羊精液常溫保存的精子活率，但過高濃度的果糖會(huì)顯著降低精子活率。各組的精子活率隨果糖質(zhì)量濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且0.040 g/mL 果糖添加量的精子活率最高，0.080 g/mL 果糖添加量的精子活率顯著降低。保存1～3 d、5 d、7～8 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的精子活率顯著高于其他各組；保存4 d、6 d 時(shí)，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的精子活率顯著高于0.005 g/mL 和0.080 g/mL組，但0.020 g/mL和0.040 g/mL組間差異不顯著。

表1 在常溫保存下不同質(zhì)量濃度果糖對(duì)綿羊精子活率的影響%

2.2 在常溫保存下不同質(zhì)量濃度果糖對(duì)綿羊精子活力的影響

由表2可知，添加適宜濃度的果糖可以提高綿羊精液常溫保存中的精子活力，但添加過多的果糖會(huì)顯著降低精子活力。各組的精子活力隨果糖質(zhì)量濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且0.080 g/mL果糖添加量的精子活力顯著降低。保存1 d 時(shí)，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的精子活力顯著高于0.005 g/mL和0.080 g/mL組；保存2 d時(shí)，0.010、0.020和0.040 g/mL果糖添加量的精子活力均顯著高于0.005 g/mL和0.080 g/mL組；保存3 d時(shí)，0.020 g/mL和0.040 g/mL 組的精子活力顯著高于0.005 g/mL 和0.080 g/mL組；保存4 d時(shí)，0.020 g/mL和0.040 g/mL組的精子活力顯著高于其他各組；保存5～7 d時(shí)，0.040 g/mL組的精子活力顯著高于其他各組。

表2 在常溫保存下不同質(zhì)量濃度果糖對(duì)綿羊精子活力的影響%

2.3 在常溫保存下不同濃度果糖對(duì)綿羊精子運(yùn)動(dòng)性能的影響

由表3可知，保存2 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的直線速率最高，但與其他各組差異不顯著；保存3 d 時(shí)，0.020 g/mL 果糖添加量的直線速率顯著高于0.005 g/mL 和0.080 g/mL 組，但與其他組差異不顯著；保存4～5 d 時(shí)，0.080 g/mL 果糖添加量的直線速率顯著低于其他各組；保存6 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的直線速率最高，且顯著高于0.010 g/mL、0.020 g/mL 和0.080 g/mL 組；保存7 d 時(shí)，0.040 g/mL果糖添加量的直線速率最高，且顯著高于0.005、0.010 和0.080 g/mL 組；保存8 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的直線速率最高，且顯著高于0.080 g/mL組，但與其他組間差異不顯著。

表3 在常溫保存下不同質(zhì)量濃度果糖對(duì)綿羊精子運(yùn)動(dòng)性能的影響

續(xù)表

保存2 d、5 d 和8 d 時(shí)，0.080 g/mL 果糖添加量的精子曲線速率、路徑速率顯著低于其他各組；保存3 d 時(shí)，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的曲線速率、側(cè)擺幅度顯著高于其他各組，但0.020 g/mL 與0.040 g/mL 組間差異不顯著；保存4 d時(shí)，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的曲線速率、路徑速率、側(cè)擺幅度顯著高于0.080 g/mL 組；保存6～7 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的曲線速率、路徑速率、側(cè)擺幅度最高，且顯著高于其他各組。保存2 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的路徑速率、側(cè)擺幅度最高，且顯著高于0.080 g/mL 組；保存3 d 時(shí)，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的路徑速率顯著高于其他各組；保存5 d時(shí)0.080 g/mL果糖添加量的路徑速率、側(cè)擺幅度顯著低于其他各組。保存1～4 d、6～7 d 時(shí)，0.040 g/mL 果糖添加量的移動(dòng)角度最高，且顯著高于0.080 g/mL 組；保存5 d 時(shí)，0.040 g/mL果糖添加量的移動(dòng)角度顯著高于其他各組。

3 討 論

由于綿羊精子結(jié)構(gòu)的特殊性，導(dǎo)致其對(duì)超低溫冷凍的不耐受，容易造成精子結(jié)構(gòu)的損傷，在解凍后精子活率低、人工授精后受胎率低下，現(xiàn)階段的綿羊凍精技術(shù)不夠成熟；另一方面由于綿羊凍精技術(shù)操作的復(fù)雜性以及高昂設(shè)備費(fèi)，目前在生產(chǎn)實(shí)踐中的使用價(jià)值不大[9]。鮮精、常溫和低溫保存的精液具有精子活力高、精子密度大、成本低、操作簡(jiǎn)單和對(duì)精子的損傷較小等優(yōu)點(diǎn)，但是其保存時(shí)間較短，精子有效存活時(shí)間不能滿足生產(chǎn)實(shí)踐需要。精子活力代表著精子直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的能力，與精子受精能力關(guān)系密切，是反映精子功能和評(píng)價(jià)精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，是精子穿過生殖道、與卵母細(xì)胞成功結(jié)合的前提[10-11]。

糖類物質(zhì)是精液稀釋液中的重要組成成分，在稀釋液中有重要的作用。首先，糖類物質(zhì)可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為精子的生存、運(yùn)動(dòng)和代謝提供能量；糖類物質(zhì)還可以提高過氧化物酶的活性，防止細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，保持細(xì)胞膜通透性的穩(wěn)定。其次，糖類物質(zhì)可以調(diào)節(jié)精子的滲透壓，防止?jié)B透壓改變對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的損傷，可以保持精子的活力、受精能力和膜結(jié)構(gòu)的完整；精子膜結(jié)構(gòu)對(duì)于其獲能、頂體反應(yīng)、穿過透明帶和維持自身代謝等非常重要，完整的頂體對(duì)頂體反應(yīng)的發(fā)生至關(guān)重要，若頂體受到損傷，受精過程就不能完成。最后，在超低溫冷凍保存中，糖類物質(zhì)還可以作為非滲透性保護(hù)劑，不能進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，在特定溫度下可以降低溶質(zhì)濃度，提高胞外的滲透壓，避免胞內(nèi)水分外流而使細(xì)胞皺縮，且糖類物質(zhì)具有一定的黏性，吸附在精子細(xì)胞的外圍，可以減少胞內(nèi)冰晶的形成，在一定程度上避免精子膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，提高解凍后的精子活率和頂體完整性[12-15]。

李新紅等[16]在對(duì)藍(lán)狐精子的研究中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中糖類物質(zhì)的添加與否對(duì)精液短期保存的質(zhì)膜完整率和頂體完整率有顯著影響；毛冉等[17]在杜泊羊精子的研究中發(fā)現(xiàn)，有糖類物質(zhì)添加時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)如精子平均活率、存活時(shí)間、質(zhì)膜完整率和頂體完整率均顯著高于沒有糖類物質(zhì)添加組；有較多的研究表明，果糖和葡萄糖是精子的主要能量來源，且添加果糖時(shí)的犬精子解凍后的精子活率高于添加葡萄糖時(shí)的精子活率；葉小萍等[18]在人精子的研究中發(fā)現(xiàn)，精漿果糖含量與精子活動(dòng)力有顯著的相關(guān)性，精漿果糖含量越高，精子活動(dòng)力越強(qiáng)；邱建華[19]在山羊精液的研究中發(fā)現(xiàn)，無論是否使用卵黃包被，適宜濃度的葡萄糖可以提高精子活率，過高濃度的葡萄糖則會(huì)影響精子活率；劉鑫[20]在豬精子的研究中發(fā)現(xiàn)，添加中間適宜濃度的果糖可以顯著提高精子活率和質(zhì)膜完整率。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，精液的保存品質(zhì)并非與稀釋液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加量成正比，在綿羊精液常溫保存稀釋液中添加適宜濃度的果糖可以提高精液常溫保存品質(zhì)，過高濃度的果糖則會(huì)降低精子活率、活力，縮短精子保存時(shí)間，與上述研究結(jié)果相一致。這可能是由于過高濃度的果糖會(huì)影響精液稀釋液的滲透壓等理化性質(zhì)，另一方面還可能是過量的葡萄糖使精子產(chǎn)生過多的代謝廢物，使精子酸中毒死亡[21]。本試驗(yàn)中適宜濃度果糖提高精子活力的原因可能是糖分子的羥基跟脂質(zhì)雙分子層的頭端極性基團(tuán)磷脂結(jié)合成穩(wěn)定的氫鍵，進(jìn)而穩(wěn)定質(zhì)膜[22-23]。

4 結(jié) 論

在綿羊精液常溫保存中添加適宜濃度的果糖可以改善精液保存品質(zhì)，提高精子存活時(shí)間，最適宜的果糖添加濃度是0.040 g/mL。