林 海，袁小亮

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/國家老年醫(yī)學(xué)臨床研究中心贛南分中心，江西 贛州 341000）

社區(qū)獲得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）是一種常見的感染性疾病，部分CAP經(jīng)初始抗感染治療無明顯改善甚至惡化，即無反應(yīng)性肺炎（Nonreactive pneumonia，NP），其病死率為普通CAP的3～5倍，總病死率可高達(dá)49.00%［1］，因此引起感染的病原體的鑒定和特征分析對于準(zhǔn)確治療和加速康復(fù)極為重要［2］。多數(shù)患者住院前已使用過抗生素抗感染治療，以致傳統(tǒng)檢測方法費(fèi)時且陽性檢出率低［3］。此外，基于培養(yǎng)的技術(shù)，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)和免疫學(xué)分析只針對目前已知的一小部分病原體，且敏感性欠佳，因此通常容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，可能導(dǎo)致濫用或過度使用抗生素［4］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于全基因組的新一代微生物測序（Next-generation sequencing，NGS）的價值逐漸被人們所認(rèn)識，特別是用于檢測罕見、非典型或生長緩慢的微生物［5］。NGS主要用于臨床評估無菌體液，包括腦脊液、血液和關(guān)節(jié)積液［6］。對于非無菌體液，如痰和支氣管肺泡灌洗液（BALF），NGS的應(yīng)用相當(dāng)有限。除了人類基因組干擾和其他常見問題之外，對NGS結(jié)果的解釋（區(qū)分定植和感染）也是一個主要問題。近年來，mNGS在呼吸道感染病原學(xué)檢測和鑒定中的可行性已被證實(shí)［7］。本研究總結(jié)了30例無反應(yīng)性肺炎患者BALF的mNGS結(jié)果，并試圖通過對測序結(jié)果的解讀，驗(yàn)證mNGS在無反應(yīng)性肺炎診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料與標(biāo)本收集 回顧性分析2019年1—12月我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的30例無反應(yīng)性肺炎患者的臨床資料（參照《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南2016版》標(biāo)準(zhǔn)）［8］。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18歲；②符合《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》2016版本中無反應(yīng)性肺炎的診斷；③排除支氣管鏡檢查禁忌癥，并簽署有創(chuàng)操作知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期婦女；②合并肺外感染。

所有患者入院后立即進(jìn)行血液檢測，評估白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白（CRP）和降鈣素原（PCT）等炎癥標(biāo)志物。所有患者均通過胸部CT檢查，以評估肺部病灶情況。隨后需要對這些患者的疾病狀況進(jìn)行支氣管鏡檢查，以便收集BALF液，通過mNGS分析進(jìn)一步進(jìn)行病原體鑒定，以促進(jìn)臨床治療。由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生行支氣管鏡檢查，采集BALF樣本，將5 mL規(guī)格標(biāo)本置于無菌痰液容器中，?20℃保存，送華大基因科技有限公司（中國深圳）行mNGS檢測。剩下的標(biāo)本送微生物及分子檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌、真菌涂片和培養(yǎng)，卡氏肺孢子蟲（PC）涂片，抗酸染色；熒光定量PCR檢測巨細(xì)胞病毒（CMV）、流感A/B病毒、PC、結(jié)核分枝桿菌、支原體和衣原體。

1.2 mNGS檢測內(nèi)容與檢測方法 對樣本中的核酸進(jìn)行檢測，鑒定樣本中存在的可疑致病微生物，可檢測范圍包括基因組序列已知的6350種細(xì)菌（其中包括133種分枝桿菌和122種支原體/衣原體/立克次體）、4945種病毒（包括DNA和RNA病毒）、1064種真菌和234種寄生蟲。采用高通量測序技術(shù)，對樣本中微生物核酸序列進(jìn)行分析，通過與數(shù)據(jù)庫中已有微生物的核酸序列進(jìn)行比對，從而對微生物進(jìn)行鑒定。高通量測序檢測過程包括：核酸提取、文庫構(gòu)建、測序、信息分析、報告解讀等（具體詳見深圳華大基因科技有限公司詳細(xì)說明）。

檢出總序列數(shù)：經(jīng)高通量測序方法檢測得到的核酸序列總數(shù)。

檢出序列數(shù)：樣本中檢出的微生物核酸序列的總數(shù)。

1.3 檢測結(jié)果的判讀 判定為感染性病原體需滿足下列任一條件［9］：（1）細(xì)菌的判定要求檢出序列數(shù)≥100，基因組覆蓋度＞0.3，無論培養(yǎng)或涂片結(jié)果如何；（2）培養(yǎng)和mNGS鑒定出相同的微生物，單個物種的檢出序列數(shù)≥50。如果mNGS單獨(dú)識別微生物，則認(rèn)為微生物是新的潛在病原體。這些微生物基于嚴(yán)格的臨床標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合多臨床醫(yī)生裁決，嚴(yán)格區(qū)分感染、定植和污染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS23.0進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，計數(shù)資料n（%）表示。采用卡方檢驗(yàn)比較mNGS與常規(guī)涂片、核酸檢測或培養(yǎng)方法的診斷效率，采用線性回歸分析方法評價BALF的mNGS檢測與其他因素的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例資料 30例患者均因胸部CT表明肺部病灶擴(kuò)散并伴有肺不張或胸膜積液診斷為無反應(yīng)肺炎，其中男性19例，女性11例，平均年齡（53.57±18.71）歲，9例合并呼吸衰竭被送入RICU，7例患者存在免疫功能低下。入院時發(fā)熱持續(xù)時間平均為（7±2.82）天，13例患者在就診前7天出現(xiàn)發(fā)熱。白細(xì)胞總數(shù)為2.25×109·L-1～22.13×109·L-1，淋巴細(xì)胞總數(shù)為0.35×109·L-1～11.2×109·L-1，中性粒細(xì)胞總數(shù)為1.03×109·L-1～22.37×109·L-1。其中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞正常的病例數(shù)分別為14例、17例、21例。16例血清CRP高于10.0 mg·L-1，22例PCT高于0.5μg·L-1。所有病例均采用經(jīng)驗(yàn)性抗生素抗感染治療，并完善支氣管鏡檢查，起病后氣管鏡檢查平均天數(shù)為（9.3±6.36）天。見表1。

表1 30例患者一般資料

2.2 病原學(xué)檢測與分析 根據(jù)感染的定義，排除了常見的細(xì)菌定植。BALF mNGS與細(xì)菌培養(yǎng)、涂片/PCR比較，mNGS的診斷陽性率均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0.020和0.036），其中有6例mNGS檢測結(jié)果為陽性，培養(yǎng)、涂片及PCR檢測結(jié)果均為陰性。樣本共檢測出現(xiàn)肺孢子菌?。≒neumocystis carinii pneumonia，PCP）共5例（1例序列數(shù)為23），其中3例為免疫功能低下患者，除1例免疫功能低下患者外，其余病例采用涂片或核酸法亦檢測出PCP，而mNGS檢出陽性率為100%。7例免疫功能低下患者樣本中共檢測PCP 3例，CMV 2例，鏈球菌1例，1例銅綠假單胞菌，1例曲霉菌。樣本中共檢測病原體考慮為定植主要有白色念珠菌、腸球菌、鏈球菌、鮑曼不動桿菌、人類皰疹病毒4型、窄食單胞菌、馬拉色菌及奈瑟菌等。1例患者的mNGS和傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果均為陰性，后經(jīng)皮肺穿刺病理診斷為肺結(jié)核；另有1例患者傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果為陰性，mNGS檢出PCP序列數(shù)少于50，后經(jīng)全院擴(kuò)大會診后考慮為不排除PCP感染可能，但至患者死亡仍未能確診病原學(xué)（表2、表3）。

表2 mNGS與傳統(tǒng)檢測方法病原檢測結(jié)果對比

表3 mNGS與傳統(tǒng)檢測方法檢出并判斷為感染的病原體屬及樣本數(shù)

對于mNGS中序列數(shù)小于50的樣本，可間接反映下呼吸道細(xì)菌和真菌菌群的多樣性。線性回歸分析顯示：檢出菌群數(shù)的差異與起病至采樣的間隔時間顯著相關(guān)，表現(xiàn)為間隔時間越長，mNGS檢測病原體菌群數(shù)越多；而與吸煙史長短及白細(xì)胞、CRP、PCT等炎癥指標(biāo)情況無關(guān)（圖1）。

圖1 mNGS檢測病原體屬數(shù)的差異與起病至采樣間隔時間的關(guān)系

2.3 治療策略 12例患者因mNGS發(fā)生了治療策略的改變，其有4例mNGS陽性發(fā)現(xiàn)（2例PCP、1例結(jié)核分枝桿菌、1例曲霉菌），以及對于鮑曼不動桿菌、煙曲霉感染，mNGS較培養(yǎng)法更早地鑒定了病原菌，使得及時更改了有效地抗感染治療。1例患者實(shí)驗(yàn)室方法和mNGS結(jié)果均為陰性，結(jié)合其自身免疫系統(tǒng)檢測指標(biāo)，與風(fēng)濕免疫科會診后考慮皮肌炎，予轉(zhuǎn)入風(fēng)濕免疫科給予相關(guān)治療。此外1例患者的mNGS和常規(guī)方法結(jié)果均為陰性，結(jié)合其感染證據(jù)不足和肺部CT的動態(tài)改變，考慮為感染后機(jī)化 性肺炎，予甲潑尼松龍治療后病灶吸收明顯（表4）。

表4 mNGS病原體檢測結(jié)果及其導(dǎo)致治療策略的改變

3 討論

mNGS適用于傳統(tǒng)檢測技術(shù)無法識別的病原體的檢測，也適用于患者對標(biāo)準(zhǔn)化抗感染治療無反應(yīng)的情況［10］。對于稀有或生長緩慢的病原體，mNGS在縮短病原體的確診時間和促進(jìn)針對性的抗感染治療等方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢，能極大地改善患者的預(yù)后［11］。然而，mNGS應(yīng)與流行病學(xué)和臨床特征相結(jié)合，才能確定病原微生物。由于技術(shù)方面（如消除宿主基因影響的方法）和結(jié)果的解釋，mNGS的應(yīng)用仍存在爭議。到目前為止，關(guān)于mNGS的研究大多集中在其對特定細(xì)菌感染的診斷價值［12］，關(guān)于準(zhǔn)確解釋所有檢測結(jié)果的文獻(xiàn)很少。本研究根據(jù)文獻(xiàn)［13］，通過分析BALF臨床樣本中微生物DNA水平及其相對豐度水平來鑒定致病菌。該方法顯著提高了病原學(xué)檢測的敏感性，對臨床實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。

有文獻(xiàn)表明［14］，mNGS鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的陽性率較差。本研究發(fā)現(xiàn)1例患者的Xpert MTB/RIF結(jié)果和另1例患者的痰抗酸染色涂片為陽性，mNGS提示存在結(jié)核分枝桿菌，但未能鑒定出特異性菌株，mNGS能輔助結(jié)核感染的診斷，而菌株的鑒定及耐藥性分析仍需依賴于培養(yǎng)菌的全基因組測序。30例患者中有12例改變了治療策略，可能是因?yàn)槲铱剖罩无D(zhuǎn)入患者較多，多數(shù)患者入院前已予抗感染治療，入院后給予強(qiáng)效、廣譜抗感染治療，但通過BALF聯(lián)合mNGS能更好地優(yōu)化抗感染治療策略。在本研究中，傳統(tǒng)的方法與mNGS的高符合率進(jìn)一步驗(yàn)證了mNGS的有效性和準(zhǔn)確性。對于檢測能力有限的醫(yī)院，建議根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)特征，特別是對免疫功能低下的患者和有嚴(yán)重或復(fù)雜感染的患者，推薦使用mNGS檢測。

基于序列數(shù)和相對豐度，mNGS技術(shù)可用于半定量檢測［15］。本研究有2例患者經(jīng)歷了2次BALF mNGS檢測，PC和腺病毒核酸序列數(shù)的動態(tài)變化可以間接反映治療效果。此外，mNGS可用于腺病毒基因分型，從而提供更好的臨床實(shí)踐指導(dǎo)［16］。因病毒培養(yǎng)困難且核酸檢測的假陽性率較高，檢測到的DNA病毒是否為致病性微生物的報道較少，而mNGS測定的序列數(shù)和相對豐度可為確定病毒感染的提供一定的依據(jù)，但是需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其最佳參考值。

mNGS還能識別不同條件下氣道菌群的分布。文獻(xiàn)表明氣道菌群組成與吸煙史無關(guān)，而與機(jī)械通氣時間有關(guān)［17］。本研究表明起病至采樣的間隔時間與呼吸道菌群存在一定相關(guān)性。下呼吸道是一個相對無菌的解剖部位，但隨著疾病時間的延長，呼吸道菌群類型可能會發(fā)生變化，這可能與菌群遷移有關(guān)，而呼吸道微生物群落多樣性的喪失，可作為一個呼吸道感染的標(biāo)志［18］。

本研究受到樣本量小和納入患者有基礎(chǔ)疾病等多重限制，同時未進(jìn)行全基因組RNA測序，可能存在有些RNA病毒尚未被檢測到，且也未進(jìn)行耐藥性測試。雖然mNGS在呼吸道感染性疾病中已被廣泛接受和應(yīng)用，但mNGS的成本可能仍然是大多數(shù)醫(yī)院在常規(guī)診斷中實(shí)施的障礙，同時也尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來修改或指導(dǎo)臨床治療策略，特別是在樣品制備和數(shù)據(jù)處理方面，限制了其在臨床研究中的廣泛應(yīng)用。然而，在臨床診斷中實(shí)施mNGS是有前景的，應(yīng)該被臨床醫(yī)生接受，在傳統(tǒng)的分子方法無法發(fā)現(xiàn)病原體或病情復(fù)雜的情況下，mNGS作為一種診斷工具是有優(yōu)勢的。

4 結(jié) 論

宏基因組NGS可提高無反應(yīng)肺炎病原菌檢測的敏感性，在縮短病原體的確診時間和促進(jìn)針對性的抗感染治療等方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢，能極大地改善患者的預(yù)后。此外，mNGS將提供更多特定菌株的信息，將有助于識別新的病原體，并可能有助于追蹤和控制感染暴發(fā)。如mNGS能進(jìn)一步對宿主的炎癥介質(zhì)或免疫相關(guān)因子及病原體耐藥性也進(jìn)行檢測及分析，將給抗感染精準(zhǔn)治療帶來更大的獲益。