張歡歡 唐金強(qiáng) 周忠志 史 瑄 黃湘寧 李 淼 曹海琳 侯鋮宇 洪愷祺 陳 麗

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

糖尿病慢性創(chuàng)面作為糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一，中醫(yī)辨證多屬陰證，血管新生障礙是導(dǎo)致其經(jīng)久難愈的主要原因。目前中醫(yī)多采用中藥湯劑內(nèi)服結(jié)合創(chuàng)面外用藥膏的方法治療；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用包括納米銀、富血小板血漿和干細(xì)胞移植等方法治療。但糖尿病慢性創(chuàng)面患者多因同時(shí)患有周?chē)窠?jīng)障礙、周?chē)懿∽兓蛘咭騽?chuàng)傷而導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈，截肢率高，不僅對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源及家庭財(cái)力造成負(fù)擔(dān)，更影響患者的生存質(zhì)量[1]。因此，探索糖尿病慢性創(chuàng)面經(jīng)濟(jì)有效的治療方法是亟待解決的問(wèn)題。溫陽(yáng)生肌膏治療糖尿病陰證慢性創(chuàng)面臨床取得明顯療效，但尚不足夠清楚其作用機(jī)制。為此，我們觀察了溫陽(yáng)生肌膏對(duì)糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面的治療效果及CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和微血管密度（MVD）在其創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制中所起的作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，5周齡，體質(zhì)量180～220 g[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002]。實(shí)驗(yàn)全程對(duì)動(dòng)物的處理符合文獻(xiàn)[2]中動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)條例。大鼠于室溫20～28 ℃、濕度45%～75%條件下飼養(yǎng)，每3只1籠，共20籠。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、飲食。高脂乳劑原料為丙硫氧嘧啶、膽酸鈉（上海源葉生物科技有限公司）和1，2-丙二醇（湖南省天虹試劑有限公司）。溫陽(yáng)生肌膏，臨床治療糖尿病陰證瘡瘍的經(jīng)驗(yàn)方，由丁香、肉桂、乳香、沒(méi)藥等配伍而成，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院周忠志主任醫(yī)師研制，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01910743808.1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2型糖尿病陰證慢性創(chuàng)面大鼠模型制備 大鼠每日以2 mL高脂乳劑灌胃1次，連續(xù)14 d后，禁食不禁水16 h，腹腔注射質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的鏈脲佐菌素溶液50 mg/kg（檸檬酸緩沖液溶解制成），72 h后尾靜脈采血，連續(xù)3 d檢測(cè)隨機(jī)血糖濃度＞16.7 mmol/L為2型糖尿病模型制備成功[3]。于糖尿病模型大鼠股部外側(cè)肌肉注射氫化可的松注射液20 mg/kg，每日1次，共3 d，可觀察到實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)較正常大鼠活動(dòng)減少、喜蜷臥、體重減輕、四肢末端較涼、毛發(fā)枯糙等表現(xiàn)，符合2型糖尿病陰證大鼠體征。2型糖尿病陰證大鼠模型建立成功后，以3.5 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，在背部（腰椎正中偏上）兩側(cè)對(duì)稱(chēng)部位剃毛形成2個(gè)40 mm×40 mm正方形裸皮區(qū)域，消毒后用打孔器制成2個(gè)直徑10 mm、深及筋膜層的圓形全層皮膚缺損?？扇庋塾^察到背部創(chuàng)面色澤晦暗，分泌物少而清稀，肉芽組織生長(zhǎng)緩慢，且有正氣不足和陽(yáng)氣虛衰表征，符合中醫(yī)陰證瘡瘍辯證[4]。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 將模型大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只，造模成功后次日開(kāi)始給藥。模型組創(chuàng)面不做任何處理；實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面外敷溫陽(yáng)生肌膏，均勻涂抹2 mm厚度，每日1次；對(duì)照組創(chuàng)面外敷象皮生肌膏，均勻涂抹2 mm厚度，每日1次。分別于3、7、14和21 d，取造模成功的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，觀察創(chuàng)面愈合率，并且背部創(chuàng)面組織取材。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 創(chuàng)面愈合率 對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行等焦距拍照，通過(guò)Image J圖像分析軟件測(cè)定拍攝創(chuàng)面的面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-觀察時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.2 組織病理學(xué)觀察 治療14 d大鼠背部皮膚創(chuàng)面取材，用不銹鋼大頭釘將取材的皮膚四個(gè)角平整固定于泡沫板上，待組織舒展后將其置于4%多聚甲醛中固定，脫水透明、浸蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，BA410E光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)CD34和VEGF含量 于治療7和14 d大鼠創(chuàng)面組織取材，用4%甲醛溶液浸泡一晚，石蠟包埋成塊，組織切片，片厚4 μm。常規(guī)脫蠟，水化。CD34和VEGF的表達(dá)均采用免疫組織化學(xué)二步法，采用兔單克隆抗體VEGF、CD34一抗（英國(guó)Abcam公司）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染，干燥后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察：①VEGF：細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)染色顯示棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡下視野，用Motic Med 6.0圖像分析軟件分析陽(yáng)性染色的吸光度值（A值），取平均值。②CD34：細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色的細(xì)胞為CD34陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定方法同VEGF。

1.3.4 MVD計(jì)數(shù) 每張切片沿肉芽組織基底部隨機(jī)觀察3個(gè)視野，采用Weidner計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)其中新生毛細(xì)血管數(shù)目及視野總面積，并計(jì)算MVD，取平均值。MVD=新生毛細(xì)血管數(shù)量/觀察視野面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS.25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合的肉眼觀察 ①模型組：造模后3 d，創(chuàng)面有少量膿液滲出，可見(jiàn)由創(chuàng)面周?chē)蛑行男律娜庋拷M織；7 d，創(chuàng)面膿性分泌物明顯減少，創(chuàng)緣開(kāi)始收縮，創(chuàng)面面積減小；14 d，創(chuàng)面接近愈合，存在小面積的痂皮；21 d，創(chuàng)面面積縮小，但仍未完全愈合。②實(shí)驗(yàn)組：與模型組相比，造模后3 d，創(chuàng)面分泌物較少，新生肉芽組織較為豐富，覆蓋創(chuàng)面；7 d，創(chuàng)面面積收縮情況較為明顯，創(chuàng)面干燥，表面蓋有薄層痂皮；14 d，創(chuàng)面明顯收縮，狀態(tài)良好，僅存少許痂皮；21 d，痂皮脫落，創(chuàng)面基本完全愈合。③對(duì)照組：與實(shí)驗(yàn)組相比，造模后3 d，對(duì)照組創(chuàng)周紅腫，伴有少量滲血，創(chuàng)面整體晦暗有清稀膿液滲出；7 d，對(duì)照組創(chuàng)面面積收縮情況較實(shí)驗(yàn)組差，仍有少量組織液滲出；14 d，創(chuàng)緣收縮，薄痂布滿(mǎn)創(chuàng)面；21 d，創(chuàng)面雖存少許痂皮，但基本愈合。可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果顯著。見(jiàn)圖1(封二)。

2.2 創(chuàng)面愈合率 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各觀察時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率均高于模型組（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較（, n=5, %）

表1 各組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較（, n=5, %）

注：與模型組比較：*P＜0.05；與對(duì)照組比較：▲P＜0.05

組別 造模后3 d 造模后7 d 造模后14 d 造模后21 d模型組 5.70±3.15 52.52±9.21 78.00±3.96 86.21±5.39實(shí)驗(yàn)組 7.34±2.70*▲ 64.62±8.12*▲ 92.44±3.93*▲ 96.75±2.29*▲對(duì)照組 7.01±4.99* 62.13±7.12* 83.05±5.06* 87.69±4.62*

2.3 病理學(xué)觀察 造模后14 d，模型組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量多，但仍有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管生成少，細(xì)胞排列較紊亂，皮膚結(jié)構(gòu)整體性低；實(shí)驗(yàn)組表皮層較為完整，炎細(xì)胞消退，組織細(xì)胞排列有序性高，膠原纖維排列整齊、交織成網(wǎng)，肉芽組織趨于成熟；對(duì)照組相較于實(shí)驗(yàn)組表皮層結(jié)構(gòu)層次較為紊亂，膠原排列較疏松且不規(guī)則，伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)于皮膚組織真皮層，成纖維細(xì)胞數(shù)目和毛細(xì)血管密度高于于模型組。見(jiàn)圖2（封二）。

2.4 創(chuàng)面組織CD34及MVD的變化 造模后7 和14 d，實(shí)驗(yàn)組CD34表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），模型組與對(duì)照組CD34表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；造模后14 d實(shí)驗(yàn)組CD34表達(dá)水平顯著高于模型組（P＜0.01）。見(jiàn)圖3（封二）和圖4。造模后3、7和14 d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MVD顯著高于模型組，且實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)組新生血管密度增加。見(jiàn)表2。

圖4 各組大鼠造模后7和14 d CD34表達(dá)水平的變化（n=5）

表2 各組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面MVD變化（，n=5，×10-4 μm2）

表2 各組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面MVD變化（，n=5，×10-4 μm2）

注：與模型組比較：*P＜0.05；與對(duì)照組比較：▲P＜0.05

組別 造模后3 d 造模后7 d 造模后14 d模型組 2.11±0.94 6.32±1.88 8.78±1.44實(shí)驗(yàn)組 4.21±0.94*▲ 9.83±1.84*▲ 10.53±2.11*▲對(duì)照組 4.04±0.79* 9.12±1.28* 9.83±1.09*

2.5 創(chuàng)面組織VEGF的變化 造模后7 d，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和模型組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠造模后7和14 d VEGF表達(dá)水平（n=5）

3 討 論

針對(duì)糖尿病陰證創(chuàng)面遷延難愈、反復(fù)發(fā)作等難題，傳統(tǒng)中醫(yī)藥價(jià)值巨大，亟待挖掘。糖尿病創(chuàng)面的難愈與神經(jīng)、血管的損傷，長(zhǎng)期慢性炎癥、氧化應(yīng)激損傷等有關(guān)[5-6]。中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病創(chuàng)面可辯為陰陽(yáng)兩證，陽(yáng)證創(chuàng)面屬實(shí)熱證，多由“氣滯血瘀、郁阻經(jīng)絡(luò)、郁久化熱”所致，表現(xiàn)為局部的紅腫熱痛，膿、腐等分泌物多，多治以“清熱解毒、消腫止痛”；陰證創(chuàng)面則由于陽(yáng)氣虛衰、陰血不足而致遷延難愈，氣血虛滯，無(wú)以化生，治療上多以“溫、補(bǔ)、消”為主[7]。溫陽(yáng)生肌膏在丁香、肉桂的基礎(chǔ)上加入乳香和沒(méi)藥，起到溫陽(yáng)活血、祛腐生新的效果。溫陽(yáng)促氣血運(yùn)行，瘡面恢復(fù)有化生之源，祛腐使邪毒有速去之道，使新肉能生。多年臨床證實(shí)其對(duì)糖尿病創(chuàng)面療效顯著[8]。象皮生肌膏出自《瘍科綱要》，用于創(chuàng)面治療由來(lái)已久，本研究以其作為對(duì)照。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂乳劑灌胃—腹腔注射鏈脲佐菌素—肌肉注射氫化可的松—手術(shù)除去背部皮膚的方法制備2型糖尿病陰證創(chuàng)面模型[9]。糖尿病創(chuàng)面愈合是一個(gè)多種機(jī)制參與的復(fù)雜而有序的過(guò)程，創(chuàng)面局部血管的新生貫穿整個(gè)愈合過(guò)程[10]。血管新生快、質(zhì)量佳，便能夠快速地形成血管網(wǎng)，增加血運(yùn)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)能夠及時(shí)、大量地輸送至創(chuàng)面，為創(chuàng)面愈合提供“源動(dòng)力”[11]。

本研究中，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組創(chuàng)面愈合率均高于模型組，實(shí)驗(yàn)組愈合率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。病理學(xué)觀察顯示，造模后14 d，模型組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量多，但仍有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管生成少，細(xì)胞排列較紊亂，皮膚結(jié)構(gòu)整體性低；實(shí)驗(yàn)組表皮層較為完整，炎細(xì)胞消退，組織細(xì)胞排列有序性高，膠原纖維排列整齊、交織成網(wǎng)，肉芽組織趨于成熟；相較于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組表皮層結(jié)構(gòu)層次較為紊亂，膠原排列較疏松且不規(guī)則，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞數(shù)目和毛細(xì)血管含量高于模型組。Awal等[12]研究顯示，CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞上特定表達(dá)分子，表達(dá)CD34的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移能力增強(qiáng)，具有內(nèi)皮修復(fù)和血管重建等重要作用。造模后7、14 d，實(shí)驗(yàn)組CD34表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，14 d時(shí)顯著高于模型組；造模后3、7、14 d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MVD高于模型組，并且實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組（P均＜0.05）；表明溫陽(yáng)生肌膏新生血管密度增加效果強(qiáng)于象皮生肌膏。VEGF是血管生成的必要條件，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)血管新生[13]。本研究中，造模后7、14 d，實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)水平上調(diào)，14 d時(shí)明顯高于模型組和對(duì)照組，表明溫陽(yáng)生肌膏促進(jìn)血管新生的效果較好，可為創(chuàng)面愈合提供有利微環(huán)境。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)生肌膏的藥物成分中丁香酚具有氧自由基清除作用，可降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平[14]；肉桂提取物肉桂醛通過(guò)抑制核因子-κB（NF-κB）通路的激活，改善持續(xù)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)降低血管細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)并誘導(dǎo)血紅素氧合酶1的生成，改善局部缺血狀態(tài)[15]。乳香中的11-羰基-β-乙酰乳香酸能上調(diào)CD34及VEGF；沒(méi)藥中Z-沒(méi)藥甾酮可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞DLL4蛋白的表達(dá)以促血管新生[16]。

本研究結(jié)果表明，溫陽(yáng)生肌膏通過(guò)上調(diào)CD34和VEGF表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和血管新生，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。今后將進(jìn)一步探討其對(duì)于創(chuàng)面結(jié)締組織與肌肉重塑的具體機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。