趙 寅，沈 芩，萬陽陽

（四川大學(xué)華西醫(yī)院血液科，成都 610041）

彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中經(jīng)常見到的一種疾病，占所有病例的1/3。這類淋巴瘤占臨床上的“侵襲性”或“中高度惡性”淋巴瘤的大多數(shù)病例。以前的治療方式主要是化療，但是副作用比較大，預(yù)后不良[1-2]。已經(jīng)有許多研究報(bào)道，LncRNA參與了DLBCL的生物學(xué)功能和作用，調(diào)控其發(fā)生和發(fā)展。LncRNA HULC 在DLBCL 患者中的表達(dá)具有重要的臨床意義[3]；LncRNA MUC5 B-AS1 在DLBCL 中的表達(dá)在臨床上具有十分關(guān)鍵的作用[4]；LncRNA RP11-513G11.1 參與了DLBCL的發(fā)生和發(fā)展[5]。也有很多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在DLBCL 的也有一定程度的表達(dá)，影響其發(fā)展進(jìn)程。miR-148b參與調(diào)控DLBCL藥物敏感性機(jī)制[6]；DLBCL 患者中miR-149-5p 表達(dá)下調(diào)，通過凋亡途徑影響腫瘤的發(fā)生[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LncRNA MALAT1 靶向miR-34a 對DLBCL 細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織來源

收集2019 年1 月至2020 年2 月在四川大學(xué)華西醫(yī)院治療的50例DLBCL患者為DLBCL組，其中男24 例，女26 例，年齡30～75 歲，平均（50.38±6.18）歲，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等治療。同時，選取同期到本院體檢的健康志愿者48例為對照組，其中男25 例，女23 例，年齡31～73 歲，平均（52.38±7.06）歲。對照組與DLBCL組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已取得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑

人DLBCL 細(xì)胞OCI-Ly8 購自中科院上海細(xì)胞庫，貨號：222476；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，貨號：3 332464；胎牛血清（FBS）購自美國Invitrogen 公司，貨號：1 986468；胰蛋白酶購自美國BD公司，貨號：2 755795；qRT-PCR 試劑盒購自大連寶生物科技，貨號：3 138642；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑購自北京天根生化科技有限公司，貨號：3 479924；Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自上海煊翎生物科技有限公司，貨號：22 875467；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：1766590，277547；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1（CyclinD1）、P21、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）抗體購自購自美國Santa Cruz 公司，貨號：1112903，110963，112093，114598；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Gibco公司，貨號：2 668084；MALAT1小分子干擾RNA（si-MALAT1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-34a 寡核苷酸模擬物（miR-34a mimics）及陰性對照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-34a特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-34a）及其陰性對照（anti-miR-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司，貨號：408642576。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 選對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別將si-NC、si-MALAT1、miR-NC、miR-34a mimics 轉(zhuǎn)染至OCI-Ly8 細(xì)胞中，記為si-NC 組、si-MALAT1組、miR-NC組、miR-34a組；將si-MALAT1與anti-miR-NC、si-MALAT1 與anti-miR-34a 共轉(zhuǎn)染至OCI-Ly8細(xì)胞，記為si-MALAT1+anti-miR-NC組、si-MALAT1+anti-miR-34a 組。轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）檢測細(xì)胞MALAT1和miR-34a表達(dá) 采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，以RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照qPCR 試劑盒的操作步驟進(jìn)行擴(kuò)增。分別以GAPDH和U6 為內(nèi)參照，按照2-ΔΔCt公式計(jì)算MALAT1 和miR-34a的相對表達(dá)量。引物序列如下。MALAT1，F(xiàn):5’-GGTCTCTGTGTCTTCGGAG-3’，R:5’-GGAAAACGCCTCAAT-CCCAC-3’；GAPDH，F(xiàn):5’-CACTGCCAACGTGTCAGTG-3’，R:5’-GACAAAGTGGTCGTTGAGGG-3’；miR-34a，F(xiàn):5’-TCGGCAGGAACACT GTCTGGTA-3’，R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6，F(xiàn):5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，R:5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.3.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 各組取3×104個/mL的OCI-Ly8 細(xì)胞，接種于96 孔板（100 μL/孔），每孔分別加入20 μL 的MTT 溶液，室溫孵育4 h，再加入150 μL/孔的二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩孵育10min，在490nm波長處應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測的OD值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取各組OCI-Ly8細(xì)胞，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，取適量結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞于流式管內(nèi)，加入5 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL 的PI 進(jìn)行染色，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測MALAT1 和miR-34a 的靶向關(guān)系 利用LncBase Predicted v.2 預(yù)測MALAT1和miR-34a的靶向關(guān)系。將WT-MALAT1或MUT-MALAT1 與miR-NC、miR-34a 分別轉(zhuǎn)染至OCI-Ly8細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液在冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗（1∶1 000稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜，加入二抗（1∶5 000 稀釋），室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1和miR-34a在OCI-Ly8細(xì)胞中的表達(dá)

與對照組比較，DLBCL 組中MALAT1 表達(dá)量明顯升高，miR-34a表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 MALAT1和miR-34a在OCI-Ly8細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 抑制MALAT1 表達(dá)對OCI-Ly8 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-NC 組比較，si-MALAT1 組細(xì)胞MALAT1表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；細(xì)胞活力、CyclinD1 蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；細(xì)胞凋亡率、P21蛋白、Bax蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 OCI-Ly8細(xì)胞增殖和凋亡

表2 抑制MALAT1表達(dá)對OCI-Ly8細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表2 抑制MALAT1表達(dá)對OCI-Ly8細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 MALAT1和miR-34a的靶向關(guān)系

LncBase Predicted v.2預(yù)測MALAT1與miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。與miR-NC組比較，miR-34a組野生型載體WT-MALAT1 的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而突變型載體MUT-MALAT1 的熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）,見表3。

表3 miR-NC組和miR-34a組野生型載體WT-MALAT1、突變型載體MUT-MALAT1的熒光素酶活性比較

表3 miR-NC組和miR-34a組野生型載體WT-MALAT1、突變型載體MUT-MALAT1的熒光素酶活性比較

圖2 MALAT1和miR-34a的靶向關(guān)系

2.4 干擾miR-34a可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1對OCI-Ly8細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-MALAT1+anti-miR-NC組比較，si-MALAT1+anti-miR-34a 組細(xì)胞活力、CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；細(xì)胞凋亡率、P21 蛋白、Bax蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖3、表4。

圖3 Western blotting檢測OCI-Ly8細(xì)胞蛋白表達(dá)

表4 干擾miR-34a可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1對OCI-Ly8細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表4 干擾miR-34a可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1對OCI-Ly8細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

DLBCL是血液系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，也是NHL的一種，成人最常見的淋巴系統(tǒng)腫瘤，主要指的是細(xì)胞核大于2 個正常淋巴細(xì)胞的大B 細(xì)胞構(gòu)成的，伴有彌漫生長的腫瘤。常見臨床癥狀是發(fā)熱、進(jìn)行性淋巴結(jié)腫大和結(jié)外腫塊[8-9]。LncRNA 靶向miRNA 可以調(diào)控腫瘤和癌癥的進(jìn)展，影響其增殖、凋亡、遷移和侵襲。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，DLBCL 細(xì)胞中MALAT1 表達(dá)量明顯升高，miR-34a 表達(dá)量明顯降低。抑制MALAT1 表達(dá)，DLBCL 細(xì)胞細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，在DLBCL組織中MALAT1表達(dá)明顯升高，下調(diào)MALAT1 表達(dá)可抑制DLBCL 細(xì)胞增殖[10]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。黃珊等[11]研究表明，MALAT1 在DLBCL患者中的高表達(dá)與多項(xiàng)臨床病理參數(shù)有關(guān)，有望成為判斷DLBCL患者預(yù)后的標(biāo)志物。有類似的研究報(bào)道，Lnc RNA AK093987在DLBCL中高表達(dá)，有可能成為DLBCL 獨(dú)立的預(yù)后腫瘤標(biāo)志物[12]。李攀等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA KCNQ1OT1在DLBCL患者外周血中高表達(dá)，并且是DLBCL 患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

miRNA 是一類長度為20 多個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列生物學(xué)過程。研究表明，miRNA 直接參與了DLBCL 的發(fā)生、發(fā)展。武君等[14]研究結(jié)果顯示，miR-34a通過靶向FOXP1 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DLBCL 細(xì)胞凋亡。類似的研究結(jié)果表明，miR-215在DLBCL患者病理組織中低表達(dá)，miR-215 靶向抑制KDM1B 表達(dá)，抑制DLBCL細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15]。聞淑娟等[16]研究顯示，下調(diào)miR-9 通過靶向FOXP1 促進(jìn)DLBCL 細(xì)胞的增殖和侵襲。王馨瑗[17]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-155、miR-15a、miR-16-1 與DLBCL 近期療效，臨床分期密切相關(guān)，有望成為DLBCL 新一代腫瘤標(biāo)記物。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4證明，細(xì)胞活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），說明干擾miR-34a可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1 對DLBCL 細(xì)胞增殖和凋亡的影響。LncRNA 與DLBCL 關(guān)系的聯(lián)系十分密切[18]。已經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，LncRNA SNHG8通過海綿miR-335-5p促進(jìn)DLBCL的增殖并抑制其凋亡[19]。

綜上所述，MALAT1在DLBCL細(xì)胞中高表達(dá)，miR-34a在DLBCL細(xì)胞中低表達(dá)，抑制MALAT1通過上調(diào)miR-34a表達(dá)抑制DLBCL細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，為該疾病的治療提供理論依據(jù)。