楊 雪，馮志星，彭麗娜，馬海濱，單 珊，韓海平

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056001）

喉癌是一種耳鼻喉頸科常見的惡性腫瘤之一，其中喉鱗狀細胞癌是最為常見，發(fā)病率約占全身惡性腫瘤1.5%，是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。喉癌有聲音嘶啞、發(fā)生困難和呼吸困難等臨床表現(xiàn)[1-2]，還具有易復發(fā)和易轉(zhuǎn)移等特點，同時對于放化療不敏感，手術(shù)治療是目前針對喉癌的主要手段，但預后效果還是不盡人意，5年生存率僅為63%[3]。有研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響喉癌患者預后的主要因素之一[4-5]。MMP-2 是具有分解細胞外基質(zhì)能力的非糖化的明膠酶，與肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6-7]。同時，缺氧也是促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF）合成的最為重要的因素，有研究表明，在缺氧條件下細胞內(nèi)的VEGF 存在過表達數(shù)倍的現(xiàn)象[8]。腫瘤血管形成在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著不可或缺的角色，VEGF及其受體參與了肝細胞癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的血管的生成[9～10]。本研究通過檢測喉癌組織中MMP-2 和VEGF 的表達，分析MMP-2 和VEGF的表達對癌癥轉(zhuǎn)移的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2013 年8 月至2018 年11 月經(jīng)手術(shù)治療并經(jīng)過病理證實的53 例喉癌患者的包埋石蠟標本（喉癌組）及其癌旁組織（癌旁組)，其中男42 例，女11例，年齡37～73歲，平均（55.49±7.50）歲。研究對象均為喉鱗狀細胞癌，病理分型：高分化37例，中分化11 例，低分化5 例；原發(fā)部位：聲門型33 例，聲門下型13例，聲門上型7例；TMN分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39 例。所選標本均在術(shù)后2 h內(nèi)處理。

1.2 主要試劑

MMP-2 兔抗人多克隆抗體、VEGF 兔抗人多克隆抗體均由Cell Signaling Technology 公司提供。SP9000 試劑盒由中杉金橋公司提供，DAB 顯色試劑均由博士德生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測MMP-2和VEGF表達情況

將石蠟標本切片后用二甲苯脫蠟、梯度乙醇（100%、100%、95%、95%和85%各3 min）、PBS沖洗后，經(jīng)枸椽酸緩沖液高壓修復2 min，PBS沖洗，浸泡在含3%的H2O2的去離子水中10 min，PBS 沖洗，加山羊血清工作液封閉15 min后去血清，加入對應一抗（MMP-2 和VEGF 抗體，工作濃度均為1∶50）于4 ℃冰箱孵育過夜，用PBS 沖洗后加即用型生物素標記的二抗，室溫孵育15 min，滴加辣根酶標記的鏈霉卵血清工作液15 min，經(jīng)PBS 沖洗后加新配置的DAB溶液顯色，水洗、蘇木精復染、脫水、封片，最后用顯微圖像分析系統(tǒng)分析處理，MMP-2和VEGF均用積分光密度值(Integrated Optical Density，IOD)表示。以PBS替代一抗作為染色的陰性對照。

1.3.2 MMP-2和VEGF的表達對喉癌相關(guān)性分析

采用Spearman 分析喉癌組織中MMP-2 和VEGF的表達與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差()表示，兩間比較采用t檢驗，多組均值比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗；MMP-2 和VEGF 的表達與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分析采用Spearman 分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織和癌旁組織MMP-2和VEGF的表達情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，MMP-2在喉癌組織中主要彌漫性分布在胞漿中，在癌旁組織中呈弱表達；VEGF在喉癌組織中在血管周圍染色明顯，在癌旁組織中呈弱表達，見圖1、圖2。喉癌組織中MMP-2 和VEGF 的表達均明顯高于癌旁組織（t=10.563、7.815，P＜0.05），見表1。

表1 喉癌組織和癌旁組織MMP-2和VEGF的表達比較

表1 喉癌組織和癌旁組織MMP-2和VEGF的表達比較

圖1 喉癌組織MMP-2和VEGF的表達情況（×400）

圖2 癌旁組織MMP-2和VEGF的表達情況（×100）

2.2 MMP-2 和VEGF 的表達對喉癌臨床病理特征的影響

53例患者中，喉癌組織MMP-2和VEGF的表達在性別、年齡和原發(fā)部位中差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在病理分型、TMN分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MMP-2和VEGF的表達均升高（P＜0.05），見表2。

表2 MMP-2和VEGF的表達對喉癌臨床病理特征的影響

表2 MMP-2和VEGF的表達對喉癌臨床病理特征的影響

與高分化組比較，*P＜0.05；與中分化組比較，#P＜0.05；；與Ⅰ期相比較，△P＜0.05，與Ⅱ期相比較，▲P＜0.05，與Ⅲ期相比較，○P＜0.05。

2.3 MMP-2 和VEGF 表達水平與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MMP-2 和VEG 水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.736、-0.588，均P＜0.05）。

3 討論

有研究認為，吸煙、飲酒、職業(yè)因素、空氣污染、性激素及病毒感染均與喉癌發(fā)生密切相關(guān)[4]。喉癌盡管是頭頸部常見腫瘤之一，盡管近年來醫(yī)療手段有了明顯的進步，但喉癌患者手術(shù)生存率仍有下降趨勢[11]。影響其預后的主要因素之一就是腫瘤轉(zhuǎn)移，由于喉癌早期癥狀不明顯，部分患者就醫(yī)時已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，采用手術(shù)治療還需要行淋巴結(jié)清除術(shù)，同時術(shù)后伴有并發(fā)癥[12]。

MMP-2 由12 個內(nèi)含子以及13 個外顯子組成，基因長度為27 kb，多項研究顯示，MMP-2能降解細胞外基質(zhì)的主要成分，細胞外基質(zhì)能起到穩(wěn)定細胞的作用，是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的一道屏障，當細胞外基質(zhì)受到降解和破壞時，腫瘤細胞更容易穿透組織細胞的基底膜和血管，轉(zhuǎn)移到其他的組織部位，因此MMP-2 表達能力越強，腫瘤細胞越不穩(wěn)定，發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的概率越大[13-14]。VEGF 廣泛存在于機體中，是血管生成不可或缺的因素，而新生血管是腫瘤發(fā)展必要條件。已有研究表明，VEGF參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對于腫瘤的增殖、遷移、侵襲有著重要的意義[15]。在本研究中，與癌旁組織相比，喉癌組織的MMP-2 和VEGF 的表達均升高，表明喉癌組織中MMP-2 和VEGF 均存在過表達，與此前研究結(jié)果相似，提示在喉癌組織中可能存在應激反應使得MMP-2及VEGF表達上調(diào)，并參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果還顯示，喉癌組織MMP-2和VEGF的表達在性別、年齡和原發(fā)部位中無明顯差異，而在病理分型、TMN 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異具有統(tǒng)計學意義。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MMP-2和VEGF的表達均升高。提示喉癌組織中MMP-2 和VEGF 的表達與喉癌的病理分型、TMN分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有密切相關(guān)。同時，Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果提示，MMP-2 和VEG 水平均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，MMP-2與VEGF在喉癌組織中存在過表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負相關(guān)。本研究在一定程度上為喉癌的早期診斷和臨床治療提供了理論參考。此外，本研究存在一些不足，如受試者均為本院所接收，因此研究在樣本選取中存在局限性，同時樣本數(shù)量不足，結(jié)果存在一定的局限性，后續(xù)應擴大樣本數(shù)據(jù)展開研究。