唐 鳳，楊春華，張萬濤，覃鴻恩，周 輝

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 1.中藥房，2.西藥房，3.制劑室，恩施 445000；4.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院西藥房,恩施 445000）

食管癌是目前世界上最普遍的癌癥之一，在癌癥相關(guān)死亡率中排名第6 位[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，大約一半的食管癌病例發(fā)生在中國，主要組織類型為鱗狀細(xì)胞癌，患者整體5 年生存率低于20%[2]。食管癌早期的臨床癥狀不顯著，通常在晚期才被診斷出來。食管癌患者預(yù)后較差與晚期診斷和癌癥轉(zhuǎn)移的趨勢有關(guān)[3]。目前，同步放化療仍然是晚期食管癌的主要治療方法。但食管癌對現(xiàn)有化療藥物的敏感性較差，治療效果有限，且存在較大的副作用[4]。因此，開發(fā)用于治療食管癌的有效藥物具有重大意義。山姜素是從姜科植物草豆蔻種子中分離得到的一種天然類黃酮，具有多種生物作用，如抗炎、抗氧化和降血脂活性[5-6]。此外，山姜素也顯示出抵抗癌癥的巨大潛力，對卵巢癌[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]等多種癌癥細(xì)胞具有抑制作用。但其在食管癌中的作用及機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過觀察山姜素對食管癌EC9706 細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制，為開發(fā)食管癌的有效治療藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌EC9706 細(xì)胞株購買自上海酶研生物科技有限公司（貨號：CC-Y1571）；山姜素購買自上海純優(yōu)生物科技有限公司（貨號：P0133）；RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號：31800022）、胰蛋白酶（貨號：25200056）購買自美國Gibco 公司；胎牛血清（貨號：04-001-1ACS）購買自以色列BI 公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：40302ES50）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：20201ES76）、DAPI 染料（貨號：40728ES03）購買自上海翊圣生物科技有限公司；MTT 檢測試劑盒（貨號：ZY2050-500T）購買自上海澤葉生物技術(shù)公司；兔抗人Ki67（貨號：26809-1-AP）、PCNA（貨號：10205-2-AP）、Caspase-3（貨號：19677-1-AP）、Caspase-9（貨號：10380-1-AP）、Beclin1（貨號：11306-1-AP）、ATG8（貨號：11010-1-AP）、p62（貨號：18420-1-AP）、LC3（貨號：14600-1-AP）、PI3K（貨號：67071-1-Ig）、p-PI3K（貨號：60225-1-Ig）、Akt（貨號：60203-2-Ig）、p-Akt（貨號：66444-1-Ig）、mTOR（貨號：66888-1-Ig）、pmTOR（貨號：67778-1-Ig）、GAPDH（貨號：66009-1-Ig）單抗，辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（貨號：10285-1-AP）、山羊抗兔Alexa Fluor488 二抗（貨號：srbAF488-1）購買自美國Proteintech Group公司；

1.2 方法

常規(guī)復(fù)蘇食管癌EC9706 細(xì)胞，加入適量添加有10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2濃度條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)備用。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性

取對數(shù)期生長管癌EC9706細(xì)胞，以5×103個細(xì)胞每孔接種100 μL于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基為山姜素終濃度（0 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L）的RPMI 1640 培養(yǎng)基100 μL，藥物劑量參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]；分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后取出培養(yǎng)細(xì)胞，加入20 μL MTT溶液培養(yǎng)；4 h后取出培養(yǎng)基加入150 μL DMSO溶液，搖床震蕩10 min，置于酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices，SpectraMax iD）在490nm 波長下測量各孔吸光度值，以0 μmol/L 山姜素組作為對照組，計算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=各組吸光度值/對照組吸光度值×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期生長食管癌EC9706細(xì)胞，以500個細(xì)胞每孔接種于6孔板中，貼壁后，分別加入含終濃度為0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L山姜素的RPMI 1640 培養(yǎng)基2mL，隔天更換含同濃度山姜素的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至肉眼可見克隆形成時停止培養(yǎng)；棄上清液，PBS 小心清洗2 次，加入甲醇固定15 min，棄去固定液，加入Giemsa 染液染色30 min，拍照計數(shù)克隆數(shù)目，0 μmol/L山姜素組作為對照組?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)期生長食管癌EC9706 細(xì)胞，計數(shù)后以106個細(xì)胞每孔接種于96 孔板，更換培養(yǎng)基為山姜素終濃度（0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基。48 h 后離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌，棄清液，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 溶液和10 μL PI 溶液染色30 min，使用流式細(xì)胞儀（美國貝克曼，DxFLEX）檢測凋亡數(shù)，0 μmol/L山姜素組作為對照組，計算凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光染色檢測LC3在細(xì)胞中的表達(dá)量

新楊塔村的重大事項(xiàng)，涉及村民切身利益的事項(xiàng)，先由村支委提議，然后兩委會商議，監(jiān)委會列席，交黨員大會審議后，再上村民代表大會決議。

將食管癌EC9706 細(xì)胞接種到含有細(xì)胞爬片的6 孔板中，更換培養(yǎng)基為山姜素終濃度（0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，取出爬片，PBS 清洗3 次，加入4%多聚甲醛固定30 min；PBS 清洗3 次，加入0.2%Triton X-100 通透液處理15 min；PBS清洗3次，加入5%與一抗（1∶100 比例稀釋）同源血清封閉1 h；PBS清洗3次，加入稀釋好的LC3抗體，置于濕盒中4 ℃孵育過夜；PBS 清洗3 次，加入山羊抗兔Alexa Fluor488 二抗（1∶100 比例稀釋），室溫孵育2 h；PBS 清洗3 次，加入DAPI 染色10 min；洗滌，封片，置于熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)取400 倍顯微鏡視野5個，計數(shù)LC3陽性表達(dá)細(xì)胞，計算LC3陽性表達(dá)率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blotting 法檢測蛋白表達(dá)水平

取對數(shù)生長期且生長食管癌EC9706 細(xì)胞，計數(shù)后以106個細(xì)胞每孔接種于96 孔板，更換培養(yǎng)基為山姜素終濃度（0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，使用PBS沖洗細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理3～5 min，用完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，重懸細(xì)胞后用PBS清洗2次，離心棄上清。加入50 μL細(xì)胞裂解液，離心收集上清液。按照BCA法使用試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)測量濃度加入相應(yīng)體積的待測樣品于SDS-PAGE 凝膠中，轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。將PVDF 膜浸入封閉液中2 h，用TBST 清洗膜3次，每次3 min。依據(jù)試劑盒說明書加入相應(yīng)濃度GAPDH、Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9、Beclin1、ATG8、p62、LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白一抗（1∶1 000比例稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST清洗膜3次；加入對應(yīng)濃度二抗（1∶5 000 比例稀釋），室溫孵育2 h，TBST 清洗膜3次；避光加入ECL發(fā)光染色，使用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。采用TotalLab 2.0 進(jìn)行灰度分析，以GAPDH 作為內(nèi)參，計算蛋白的相對表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞活性的影響

隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞活性明顯下降；隨著培養(yǎng)時間增加，食管癌EC9706細(xì)胞活性逐漸下降。在培養(yǎng)48 h后，山姜素濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L時，食管癌EC9706細(xì)胞活性＞70%。因此，本研究選擇藥物濃度25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L，作用時間48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響

隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞克隆形成數(shù)目逐漸下降；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L 時，食管癌EC9706 細(xì)胞克隆形成率顯著低于對照組（P＜0.05），見圖1A。隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)水平逐漸下降；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L 時，食管癌EC9706 細(xì)胞Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組（均P＜0.05），見圖1B。

圖1 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響

2.3 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的影響

培養(yǎng)48 h 后，隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L時，食管癌EC9706細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（均P＜0.05），見圖2A。隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706細(xì)胞cleaved cas-3、cleaved cas-9 蛋白表達(dá)水平逐漸上升；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L 時，食管癌EC9706 細(xì)胞cleaved cas-3/cas-3、cleaved cas-9/cas-9 蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組（均P＜0.05），見圖2B。

圖2 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的影響

2.4 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞自噬的影響

隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞Beclin1、ATG8、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平逐漸上升，p62蛋白表達(dá)水平逐漸下降；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L時，食管癌EC9706細(xì)胞Beclin1、ATG8、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平顯著高于對照組，p62 水平顯著低于對照組（P＜0.05），見圖3A。隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706細(xì)胞LC3陽性數(shù)逐漸升高；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L 時，食管癌EC9706 細(xì)胞LC3 陽性率顯著高于對照組（均P＜0.05），見圖3B。

2.5 山姜素對食管癌EC9706 細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平逐漸降低；山姜素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L 時，食管癌EC9706 細(xì) 胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR顯著低于對照組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 山姜素對食管癌EC9706細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

3 討論

由于食管癌缺乏特定的早期癥狀、明顯的發(fā)病體征和早期診斷標(biāo)志物，約35%的患者就診時已進(jìn)入晚期，預(yù)后不良[9]。因此，尋找新的有效治療藥物，對延長食管癌患者的生存期具有重要意義。山姜素可抑制不同癌細(xì)胞株的增殖并誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抗癌活性。然而，山姜素對食管癌的作用仍知之甚少。本研究MMT 檢測結(jié)果顯示，隨著山姜素濃度和作用時間的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞活性明顯下降，提示山姜素對食管癌具有抗腫瘤作用。排除山姜素細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選取培養(yǎng)時間為48 h，山姜素濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

惡性腫瘤較強(qiáng)的促增殖能力和抗凋亡能力是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。本研究通過細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，隨著山姜素劑量的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞克隆形成數(shù)目逐漸減少。Ki67是一種核增殖相關(guān)抗原，存在于活躍增殖的細(xì)胞中，在細(xì)胞周期的生長和合成階段表達(dá)，可指示細(xì)胞增殖的程度[10]。PCNA 是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在大多數(shù)類型的實(shí)體惡性腫瘤中，例如結(jié)直腸癌和乳腺癌，PCNA與預(yù)后和生存密切相關(guān)[11-12]。本研究中，隨著山姜素劑量的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平逐漸下降。此外，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加。Caspase是一種天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，活化的Caspase-9可以有效切割并激活下游的Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究結(jié)果顯示，隨著山姜素劑量的增加，食管癌EC9706細(xì)胞cleaved cas-3、cleaved cas-9蛋白表達(dá)水平逐漸上升。這些結(jié)果表明，山姜素具有抑制食管癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡的能力，并且作用效果隨劑量增加而加強(qiáng)，與前人的研究結(jié)果相似[15]。

自噬是真核細(xì)胞最重要的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)之一，在不利的環(huán)境條件激活，自噬可選擇性地降解一些多余的成分，以滿足緊急情況下人體對能量的需求。近年來證據(jù)表明，自噬在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[16]。Beclin1 是參與自噬小體成核早期的關(guān)鍵蛋白，可與其他自噬相關(guān)蛋白相互作用，隨后募集ATG 蛋白，參與編排自噬小體和自溶酶體的形成[17]。此外，LC3 蛋白已被用作自噬的指標(biāo)，其存在于自噬小體的膜上，發(fā)生自噬時，LC3Ⅰ會向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ通常與自噬小體的形成程度密切相關(guān)[18]。p62 是自噬通量的重要指標(biāo)，它通過直接與自噬膜上的LC3 結(jié)合，選擇性地并入自噬體，隨后在自溶酶體中降解[19]。在本研究中，隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706細(xì)胞Beclin1、ATG8、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平逐漸上升，p62 蛋白表達(dá)水平逐漸下降，LC3 陽性率逐漸升高。表明山姜素能誘導(dǎo)食管癌EC9706 細(xì)胞自噬，并呈劑量依賴性。

廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT/mTOR信號通路已被證明參與細(xì)胞生長、增殖、凋亡和分化調(diào)控等多種代謝過程的重要信號通路[20]。這種信號的異常激活已在包括食管癌在內(nèi)的人類癌癥中廣泛報道[21]。有報道稱，一些抗癌藥物可以通過阻斷PI3K/Akt/mTOR 通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[22]。此外，通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[23]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路通過介導(dǎo)pmTOR 水平負(fù)向調(diào)控自噬，而p-Akt 是凋亡過程中的一個重要事件。在本研究中，隨著山姜素濃度的增加，食管癌EC9706 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平逐漸降低。提示山姜素能抑制食管癌EC9706細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，并可能與其誘導(dǎo)食管癌EC9706 細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)。

綜上所述，山姜素能抑制食管癌EC9706 細(xì)胞增殖，促進(jìn)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡和自噬，這可能與其能抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路有關(guān)，表明山姜素存在用于食管癌治療的潛在價值。