朱明霞，何花麗，朱芳蕓，劉 倩，姚建華

（1.西安市第四醫(yī)院麻醉科，西安 710004；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)麻醉科，咸陽(yáng) 712000）

口腔癌是最常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，超過(guò)90%的口腔癌是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），其特征是分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。盡管研究和治療方面取得了進(jìn)展，但在過(guò)去的幾十年中，OSCC 的5 年生存率很低，并且OSCC 的發(fā)生率保持在50%左右[2]。實(shí)際上，OSCC的治療包括外科手術(shù)，放療和化療。然而，由于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，晚期OSCC 患者在外科治療、化療和放療中效果較差[3]。圍手術(shù)期護(hù)理和麻醉管理被認(rèn)為是重要的因素,可能影響癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和患者生存[4]。阿片類(lèi)藥物是圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛中最常用的鎮(zhèn)痛劑類(lèi)型。舒芬太尼作為一種強(qiáng)效的阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥，起效快，消除半衰期短，對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響很小[5]。但舒芬太尼在腫瘤中的作用及其機(jī)制還不清楚。本文研究舒芬太尼對(duì)人OSCC細(xì)胞系CAL27生長(zhǎng)、侵襲和干細(xì)胞樣特性的影響以及線粒體凋亡通路的調(diào)節(jié)，以期為舒芬太尼在OSCC治療中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、DMEM 培養(yǎng)液、胰酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；RIPA 裂解緩沖液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；兔抗VEGF（ab32152，英國(guó)Abcam），兔抗Vimentin（ab92547，英國(guó)Abcam），兔抗SOX2（ab92494，英國(guó)Abcam），兔抗OCT4（ab200834，英國(guó)Abcam），兔抗Bax（ab32503，英國(guó)Abcam），兔抗Bcl-2（ab196495，英國(guó)Abcam），兔抗Caspase3（ab13847，英國(guó)Abcam）,兔抗c-Myc（ab32072，英國(guó)Abcam），兔抗GAPDH單抗（ab181602，英國(guó)Abcam）；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（ab6728，英國(guó)Abcam）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和BrdU 試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司；Transwell小室及MatrigelTM底膜基質(zhì)購(gòu)自美國(guó)BD公司；ALDEFLUOR 分析試劑盒購(gòu)自加拿大Stem Cell Technology公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)eppendorf 公司；電轉(zhuǎn)儀、電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；FACScan流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman coulter 公司；GDS-800 UVP凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人OSCC CAL27 細(xì)胞購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），在含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL 鏈霉素的DMEM 中于37 °C、含5%CO2濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率達(dá)到85%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

將CAL27 細(xì)胞以1×103/孔的密度接種到96 孔板中，加入不同濃度（0 nmol/L，1 nmol/L，2.5 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，25 nmol/L，50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L，300 nmol/L，400 nmol/L）的舒芬太尼，0 nmol/L 舒芬太尼作為對(duì)照組，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37°C孵育2 h，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm下的吸光度值，繪制折線圖并計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度/對(duì)照組細(xì)胞吸光度）。

1.4 BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖

將CAL27 細(xì)胞隨機(jī)分為4 組，分為舒芬太尼0 nmol/L組、10 nmol/L組、25 nmol/L組和50 nmol/L組，分別以1.0×104/孔的密度接種到24孔板（含蓋玻片）中，用舒芬太尼0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L處理48 h后。加入BrdU孵育2 h，固定蓋玻片上的細(xì)胞，然后用抗BrdU抗體處理過(guò)夜。PBS洗滌，然后加入底物，15 min 后測(cè)量吸光度值（370～492 nm）。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲

收集按“1.4項(xiàng)”分組處理過(guò)的細(xì)胞消化離心，加入無(wú)血清DMEM制備含有5×105cells/mL的細(xì)胞懸液。將500μL含10%FBS的DMEM添加到上腔室中。在37°C 和5%CO2中孵育24 h 后，輕輕去除未侵襲的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)凝膠。將侵入膜的細(xì)胞染色20 min，用PBS 洗滌，然后在空氣中干燥。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，用顯微鏡對(duì)入侵的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 顯微觀察腫瘤成球情況

收集按“1.4 項(xiàng)”分組處理過(guò)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27 細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)基洗1 次并重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)細(xì)胞密度。在低黏孵6 孔板中加2%B27,20 ng/mL bFGF 和20 ng/mL EGF 的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每隔2 d 補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，分別加藥處理14 d，于倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.7 流式分選ALDH陽(yáng)性細(xì)胞

將CAL27細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中，收集按“1.4項(xiàng)”分組處理過(guò)的CAL27細(xì)胞，重懸于1 mL ALDEFLUOR 緩沖液中，加入5 μL氟硼熒—氨基乙醛（BAAA）并短暫混合后，立即將300 μL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有5 μL 二乙基氨基偶氮苯（DEAB）的離心管中，用移液器均勻混合。然后將兩個(gè)離心管放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以使反應(yīng)在37°C下進(jìn)行40 min。將細(xì)胞用2 mL ALDEFLUOR 緩沖液洗滌兩次，并最終重懸于500 μL 補(bǔ)充有DAPI 的ALDEFLUOR緩沖液中以染色死細(xì)胞，在流式儀上完成樣品分析。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取按“1.4 項(xiàng)”分組處理過(guò)的CAL27 細(xì)胞，將細(xì)胞以3 000 r/min 的速度離心5 min，然后棄去上清液，并將沉淀以1.0×106細(xì)胞/mL 的密度重懸于1×結(jié)合液中。各取100 μL的樣品溶液與5 μL FITC偶聯(lián)的Annexin V和5 μL PI在室溫下避光孵育15 min，向每個(gè)樣品管中加入400 μL 1×結(jié)合液，使用FACScan 流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式分析，使用FlowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 免疫印跡法

取按“1.4 項(xiàng)”分組處理過(guò)的細(xì)胞，使用RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞樣品，BCA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平。取30 mg 蛋白質(zhì)的樣品在10% SDS-PAGE 中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用含有5%脫脂牛奶的TBST 緩沖液封閉2 h，隨后加入一抗（VEGF,1∶1 000;Vimentin,1∶1 000;SOX2,1∶1 000;OCT4,1∶1 000,Bax,1∶1 000,Bcl-2,1∶1 000,Caspase3,1∶1 000,c-Myc1∶1 000）于4 ℃孵育過(guò)夜，第2天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，洗膜后ECL曝光成像并用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的舒芬太尼對(duì)CAL27 細(xì)胞活力的影響

如圖1 所示，舒芬太尼濃度不低于25 nmol/L時(shí)，CAL27細(xì)胞的存活率較舒芬太尼濃度為0 nmol/L時(shí)顯著降低（P＜0.05），并呈濃度依賴的方式。選擇舒芬太尼0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L和50 nmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

圖1 CCK8檢測(cè)CAL27細(xì)胞活力

2.2 不同濃度的舒芬太尼對(duì)CAL27 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如圖2a所示，舒芬太尼0 nmol/L組可見(jiàn)大量綠色標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞。舒芬太尼25 nmol/L 組和舒芬太尼50 nmol/L 組綠色標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組減少。如圖2b 所示，與舒芬太尼0 nmol/L 組比較，舒芬太尼25 nmol/L組和舒芬太尼50 nmol/L組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。

圖2 不同濃度舒芬太尼對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的作用

2.3 不同濃度的舒芬太尼對(duì)CAL27 細(xì)胞侵襲力的影響

如圖3a 所示，與舒芬太尼0 nmol/L 組比較，可觀察到舒芬太尼25 nmol/L組和舒芬太尼50 nmol/L組侵入到小室膜底側(cè)的CAL27 細(xì)胞數(shù)量明顯減少。如圖3b 所示，與舒芬太尼0 nmol/L 組比較，舒芬太尼25 nmol/L組和舒芬太尼50 nmol/L組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（均P＜0.05）。

圖3 不同濃度舒芬太尼對(duì)CAL27細(xì)胞侵襲的作用

2.4 不同濃度的舒芬太尼對(duì)VEGF 和Vimentin 的蛋白表達(dá)影響

如圖4所示，與舒芬太尼0 nmol/L組比較，舒芬太尼25 nmol/L組和舒芬太尼50 nmol/L組VEGF和Vimentin的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05）。

圖4 不同濃度舒芬太尼處理后VEGF和Vimentin蛋白表達(dá)變化

2.5 不同濃度的舒芬太尼對(duì)腫瘤干細(xì)胞成球的影響

如圖5所示，與舒芬太尼0 nmol/L組比較，可觀察到舒芬太尼25 nmol/L組和舒芬太尼50 nmol/L組腫瘤干細(xì)胞成球的體積變小，數(shù)量減少。

圖5 不同濃度舒芬太尼處理后腫瘤干細(xì)胞成球的變化

2.6 不同濃度的舒芬太尼對(duì)腫瘤干細(xì)胞特性的影響

如圖6a和b所示，與舒芬太尼0 nmol/L組比較，舒芬太尼10 nmol/L 組、舒芬太尼25 nmol/L 組和舒芬太尼50 nmol/L 組ALDH+的細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。如圖6c和圖6d所示，與舒芬太尼0 nmol/L組比較，舒芬太尼25 nmol/L組和舒芬太尼50 nmol/L組SOX2和OCT4蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05）。

圖6 不同濃度舒芬太尼處理后ALDH+細(xì)胞及SOX2、OCT4蛋白表達(dá)水平的變化

2.7 不同濃度的舒芬太尼對(duì)線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與舒芬太尼0 nmol/L組比較，舒芬太尼10 nmol/L 組、舒芬太尼25 nmol/L 組和舒芬太尼50 nmol/L組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（均P＜0.05）；舒芬太尼25 nmol/L 組和舒芬太尼50 nmol/L組Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；舒芬太尼25 nmol/L 組和舒芬太尼50 nmol/L組c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05）。

圖7 不同濃度舒芬太尼處理后Bax/Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表達(dá)水平的變化

3 討論

局部麻醉藥的作用范圍很廣，其作用已超出其眾所周知的麻醉和抗心律不齊的特性。最近的研究表明，局部麻醉藥可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，在癌癥治療中發(fā)揮作用[6]。體外研究證實(shí)，局部麻醉藥對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用[7]。舒芬太尼是一種阿片類(lèi)藥物，是臨床上最常用的麻醉藥物。本研究結(jié)果表明，舒芬太尼濃度不低于25 nmol/L時(shí)明顯對(duì)CAL27 細(xì)胞具有顯著毒性作用，且CAL27 細(xì)胞的存活率以舒芬太尼濃度依賴的方式降低。本研究選擇舒芬太尼（0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

腫瘤細(xì)胞的增殖對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[8]。研究表明，舒芬太尼在體外可抑制肝癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)[9]。與前人研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果表明，舒芬太尼處理OSCC 細(xì)胞CAL27 后，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，表明舒芬太尼可抑制OSCC 細(xì)胞的生長(zhǎng)。

惡性腫瘤細(xì)胞具有向周?chē)＝M織浸潤(rùn)和侵襲的能力[10]。人OSCC 具有侵襲轉(zhuǎn)移潛能，這是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。已有研究表明，阿片類(lèi)藥物可通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），顯著降低癌細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而其中舒芬太尼治療后能降低侵襲細(xì)胞數(shù)，從而抑制NCI-H460細(xì)胞的侵襲[11]。本研究結(jié)果顯示，舒芬太尼處理OSCC 細(xì)胞CAL27 后，侵襲細(xì)胞數(shù)減少；VEGF 和Vimentin 的蛋白表達(dá)水平降低。因此，舒芬太尼可抑制OSCC細(xì)胞的侵襲能力。

OSCC 腫瘤干細(xì)胞能產(chǎn)生異質(zhì)腫瘤細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與OSCC 的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ALDH 在實(shí)體惡性腫瘤如結(jié)腸、乳腺、肝臟、肺腫瘤及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中均有表達(dá)[12]。ALDH 的表達(dá)并與口腔癌分期、耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]。在腫瘤干細(xì)胞中，SOX2在惡性鱗狀細(xì)胞的存活中起著至關(guān)重要的作用，并且可以保護(hù)腫瘤干細(xì)胞免受凋亡的影響[14]。OCT4和SOX2的表達(dá)隨著腫瘤分期和大小的減少以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的減少而增加[15]。有研究表明，OCT4 參與了OSCC內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)化、致瘤、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果顯示，舒芬太尼處理OSCC 細(xì)胞CAL27后，腫瘤干細(xì)胞成球的體積變小，數(shù)量減少；ALDH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少；SOX2,OCT4蛋白表達(dá)水平降低，提示舒芬太尼可能通過(guò)降低腫瘤干細(xì)胞特性影響OSCC的發(fā)生發(fā)展。

促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間動(dòng)態(tài)平衡的維持對(duì)于細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼可通過(guò)上調(diào)Caspase-3 表達(dá)，促進(jìn)大鼠肝癌瘤細(xì)胞的凋亡[17]。Bcl-2 和Bax 是兩種重要的細(xì)胞凋亡蛋白，Bax/Bcl-2比值決定細(xì)胞在體內(nèi)是否發(fā)生凋亡[18]。舒芬太尼通過(guò)上調(diào)Bax 蛋白表達(dá)和下調(diào)Bcl-2 蛋白表誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，舒芬太尼處理OSCC細(xì)胞CAL27后，Bax/Bcl-2 的比值和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高；c-Myc 蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示舒芬太尼可能通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2 的比值和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)，促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡。

綜上所述，舒芬太尼可抑制人OSCC 細(xì)胞系CAL27 生長(zhǎng)、侵襲和干細(xì)胞樣特性，促進(jìn)CAL27 細(xì)胞凋亡，在OSCC 中發(fā)揮抑癌作用，為舒芬太尼在OSCC的臨床治療中提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。