閆麗梅，王 靜，史 君，趙 靜，賈 鵬

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

骨結(jié)核是肺外結(jié)核累及的主要部位，約占肺外結(jié)核的30%左右。骨結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染骨、脊柱和關(guān)節(jié)所導(dǎo)致的疾病，通常發(fā)病隱匿，病程長，可影響骨骼的發(fā)育，容易致殘。骨結(jié)核中最常見的是脊柱結(jié)核，約占骨結(jié)核的50%，占全身結(jié)核的3%～5%[1]。臨床上診斷骨結(jié)核主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、局部病灶的病理結(jié)果和MTB的培養(yǎng)。但由于MTB培養(yǎng)周期長、陽性率低，而病理診斷屬于有創(chuàng)檢查，使其臨床應(yīng)用受到限制。因此，迫切需要新的檢測方法來提高骨結(jié)核的早期診斷率和準(zhǔn)確性。

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(T-SPOT.TB)檢測是近年來輔助診斷結(jié)核感染的新免疫學(xué)方法，被廣泛使用于臨床[2]。T-SPOT.TB的檢測原理是采用MTB特異性抗原早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾過蛋白10(CFP-10)肽段刺激T淋巴細(xì)胞，使其釋放γ干擾素(INF-γ)，使用酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)計數(shù)活化的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞[3]。本文評價T-SPOT.TB檢測在骨結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2013-2017年內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院和內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院送檢的疑似骨結(jié)核患者的外周靜脈血標(biāo)本212例，其中男110例、女102例，平均年齡(54.06±14.76)歲。根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、細(xì)菌學(xué)、組織病理學(xué)等診斷分為骨結(jié)核組和非結(jié)核組。骨結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理學(xué)診斷，標(biāo)本活檢的組織病理結(jié)果顯示為結(jié)核性肉芽腫和干酪樣壞死組織；(2)細(xì)菌學(xué)診斷，局部膿液抗酸染色涂片或MTB培養(yǎng)提示陽性；(3)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床表現(xiàn)、影像學(xué)等支持結(jié)核、排除其他疾病，且診斷性抗結(jié)核治療有效者。局部組織、膿液抗酸涂片和MTB培養(yǎng)陽性是目前確診骨結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)。骨結(jié)核組111例，包括脊柱結(jié)核72例(64.87%)，關(guān)節(jié)及其他部位骨結(jié)核39例(35.13%)；非結(jié)核組101例。兩組性別、年齡資料見表1。

表1 骨結(jié)核和非結(jié)核組的基本資料

1.2方法

1.2.1提取單個核細(xì)胞(PBMC) 所有患者空腹抽取靜脈全血4 mL，加入肝素鋰抗凝管。加入同比例培養(yǎng)基混勻，將稀釋后的全血緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液離心管內(nèi)，形成液面層，梯度離心分離PBMC，用細(xì)胞培養(yǎng)基清洗2次，離心后棄上清液，用AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL懸液。

1.2.2T-SPOT.TB檢測 使用T-SPOT.TB檢測試劑盒(Oxford Immunotec公司，生產(chǎn)批號：TEC220430、TEB086167、TEC233280)檢測。每個標(biāo)本設(shè)4個孔，分別將 A抗原(ESAT-6)、B抗原(CFP-10)、空白對照(AIM-V培養(yǎng)基)和陽性對照(植物血凝素)，加入到包被有INF-γ單抗的96孔板孔內(nèi)，每孔各加入50 μL，然后加入分離后的細(xì)胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱放置16～20 h，棄細(xì)胞懸液后PBS洗滌3次，分別加入二抗和底物顯色，吹干后讀數(shù)。用ELISPOT斑點分析儀(AID公司)計數(shù)斑點形成細(xì)胞(SFCs)。每個斑點代表一個活化的特異性T淋巴細(xì)胞。減去空白孔后任一孔斑點≥6為陽性，如果空白孔斑點數(shù)≥6時，任一實驗孔大于空白對照2倍為陽性。本試驗設(shè)靜脈血界值24 SFCs/106PBMC為陽性。A抗原和B抗原任一個陽性即為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)分析用GraghPad Prism 8軟件，計算診斷實驗評價指標(biāo)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值；繪制ROC曲線，確定診斷最佳臨界值。計數(shù)資料以例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1骨結(jié)核和非結(jié)核組T-SPOT.TB檢測結(jié)果比較 T-SPOT.TB檢測輔助診斷骨結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為91.89%、63.37%、73.38%、87.67%。T-SPOT.TB檢測在骨結(jié)核組和非結(jié)核組陽性數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 骨結(jié)核和非結(jié)核組T-SPOT.TB檢測結(jié)果比較(n)

2.2T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷骨結(jié)核的效能分析 外周血ESAT-6抗原診斷骨結(jié)核的最佳臨界值是46 SFCs/106PBMC，曲線下面積(AUC)是0.881 9。外周血CFP-10抗原診斷骨結(jié)核的最佳臨界值是34 SFCs/106PBMC，AUC是0.878 0。ESAT-6+CFP-10抗原診斷骨結(jié)核的最佳臨界值是88 SFCs/106PBMC，AUC是0.911 0。見表3。

表3 T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷骨結(jié)核的效能分析

2.3T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷脊柱結(jié)核的效能分析 外周血ESAT-6抗原診斷脊柱結(jié)核的最佳臨界值是50 SFCs/106PBMC，AUC是0.895 1。CFP-10抗原診斷脊柱結(jié)核的最佳臨界值是34 SFCs/106PBMC，AUC是0.878 4。ESAT-6 + CFP-10抗原診斷脊柱結(jié)核的最佳臨界值是114 SFCs/106PBMC，AUC是0.912 3。見表4。

表4 T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷脊柱結(jié)核的效能分析

3 討 論

骨結(jié)核是肺外結(jié)核的重要組成部分，其疾病進(jìn)展緩慢、無特異性臨床表現(xiàn)，容易導(dǎo)致患者的骨關(guān)節(jié)實質(zhì)性破壞，給臨床診斷和治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。骨結(jié)核通常以局部疼痛和壓痛為主要臨床表現(xiàn)，同時伴有炎性指標(biāo)增高[4]，臨床常規(guī)應(yīng)用的檢測項目包括細(xì)菌學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測、病理學(xué)檢查和影像學(xué)檢查等。細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)檢測雖然是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在一些缺陷，MTB培養(yǎng)時間長，病理學(xué)檢測屬于有創(chuàng)性檢查，而且二者檢測陽性率均較低。免疫學(xué)檢測方法主要包括結(jié)核菌素試驗和抗結(jié)核抗體檢測，其靈敏度和特異度較差[5]。MRI等影像學(xué)檢查在臨床中也有重要作用，但一些癥狀不典型或疾病早期的患者往往影像學(xué)表現(xiàn)不顯著，均給骨結(jié)核的診斷帶來了難題[6]。T-SPOT.TB是近年來出現(xiàn)的免疫檢測新方法[7]，研究證實，檢測外周血T-SPOT.TB是診斷活動性和隱匿性結(jié)核病的有效方法[8]。除檢測外周血T-SPOT.TB外，還可檢測胸腔積液、腹水、腦脊液T-SPOT.TB[9]，不同種類標(biāo)本聯(lián)合檢測T-SPOT.TB可提高結(jié)核病的診斷率[10-11]。有研究顯示，T-SPOT.TB檢測在腸結(jié)核中也有較好的輔助診斷價值[12-13]。本研究評價T-SPOT.TB檢測對骨結(jié)核的輔助診斷價值。

本研究回顧性分析了疑似骨結(jié)核患者的全血標(biāo)本212例，根據(jù)臨床診斷分為骨結(jié)核組111例和非結(jié)核組101例，均進(jìn)行了T-SPOT.TB檢測。T-SPOT.TB檢測輔助診斷骨結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別是91.89%、63.37%、73.38%、87.67%，結(jié)果提示T-SPOT.TB檢測可作為診斷骨結(jié)核的有效輔助手段。YUAN等[14]報道對65 例疑似非典型性脊柱結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測，其靈敏度和特異度分別為83%和81%。姚利等[15]納入8篇研究T-SPOT.TB檢測對脊柱結(jié)核診斷價值的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果提示外周血T-SPOT.TB檢測診斷脊柱結(jié)核的靈敏度為88%，特異度為90%，陽性似然比為8.67，陰性似然比為0.13，AUC為0.95。本研究中T-SPOT.TB檢測診斷骨結(jié)核的特異度與以上報道一致，但靈敏度略低。

臨床上使用的試劑盒上推薦的外周血T-SPOT.TB診斷臨界值是24 SFCs/106PBMC，適用于肺內(nèi)結(jié)核的診斷，但對于骨結(jié)核T-SPOT.TB的診斷臨界值報道不一。本研究根據(jù)入組患者外周血ESAT-6、CFP-10抗原單項檢測和ESAT-6+CFP-10 抗原聯(lián)合檢測，建立ROC曲線，確定診斷骨結(jié)核的最佳臨界值，骨結(jié)核外周血ESAT-6抗原的診斷最佳臨界值是46 SFCs/106PBMC，CFP-10抗原的診斷最佳臨界值是34 SFCs/106PBMC，均高于試劑盒上推薦的臨界值。脊柱結(jié)核通常占全身骨結(jié)核的發(fā)病首位，本研究病例中也顯示脊柱結(jié)核發(fā)病率較高，占骨結(jié)核組的64.87%，因此，將脊柱結(jié)核也做了單獨統(tǒng)計，其診斷最佳臨界值與骨結(jié)核組基本一致。ESAT-6+CFP-10抗原診斷骨結(jié)核的最佳臨界值是88 SFCs/106PBMC，AUC明顯優(yōu)于ESAT-6或CFP-10單抗原檢測，具有較好的靈敏度和特異度。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測可作為輔助診斷骨結(jié)核的有效方法，ESAT-6+CFP-10抗原聯(lián)合檢測的診斷效能優(yōu)于單抗原檢測。