楊彬彬, 夏 穎, 夏黎明

秸稈降解與土壤污染生物修復(fù)耦合過程的研究

楊彬彬1, 夏 穎2, 夏黎明1

(1. 浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027;2. 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310014)

秸稈資源的合理利用和土壤修復(fù)是當(dāng)前備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。本研究對秸稈快速降解與被有機(jī)物污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)的耦合過程進(jìn)行了探究。將水稻秸稈平鋪在污染土壤上，接入特定菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵12 d后秸稈基質(zhì)中漆酶活力、濾紙酶活力(即纖維素酶總活力)和木聚糖酶活力最高分別可達(dá)25.31、240.44和4 537.16 IU×g-1，秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別達(dá)到了75.4%、77.33% 和32.35%；秸稈失重率為60.19%。在耦合過程第12 d，土壤中土霉素的降解率可達(dá)93.4%、毒死蜱和2,4,5-三氯酚的降解率分別可達(dá)到62.34%和65.21%。研究結(jié)果可為秸稈快速降解還田以及被有機(jī)物污染的土壤生物修復(fù)提供參考。

秸稈降解；土壤修復(fù)；耦合；濾紙酶；漆酶；木聚糖酶；有機(jī)污染物

1 前 言

秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要廢棄物。我國的秸稈種類多、數(shù)量大，每年都有大量的秸稈資源沒有得到合理有效利用，帶來一系列的環(huán)境問題[1-2]。秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，富含氮、磷、鉀等元素。秸稈還田作為秸稈利用的一種重要方式，可以減少化學(xué)肥料的使用、有效增加土壤的有機(jī)質(zhì)含量、改善土壤結(jié)構(gòu)。但在直接還田情況下，存在秸稈降解效率低、秸稈降解周期長等問題，不利于下一茬作物的種植。

土壤污染是我國面臨的主要環(huán)境問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國受有機(jī)污染物污染的農(nóng)田達(dá)3 600萬 hm2，主要污染物包括抗生素、農(nóng)藥、多環(huán)芳烴等[3]。土霉素是一種獸用抗生素，作為動物飼料添加劑和藥物被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，不可避免地導(dǎo)致了環(huán)境污染，在我國不同區(qū)域都檢測出了土霉素的殘留[4-5]。毒死蜱是具有代表性的有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥，具有高效、廣譜的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治。毒死蜱在土壤中半衰期較長，在未滅菌土壤中1 g×kg-1的毒死蜱半衰期為278 d，而滅菌土壤中毒死蜱的半衰期是未滅菌土壤的3～4倍[6]。2,4,5-三氯酚 (2,4,5-trichlorophenol，2,4,5-TCP) 是一種典型的氯酚類污染物，它不僅廣泛應(yīng)用于下游農(nóng)藥的生產(chǎn)，其本身也可以作為農(nóng)藥使用；它毒性強(qiáng)并且難以自然降解，在環(huán)境中檢出率較高。上述這些有機(jī)污染物會在土壤表層積累、被植物吸收、對動物和人類的健康造成潛在的威脅[7-9]。

漆酶是一種多銅氧化酶，能夠利用分子氧在自由基催化機(jī)制下氧化各種酚類和非酚類物質(zhì)[10]。漆酶的底物譜廣泛，并且僅利用氧氣作為最終的電子受體，是一種環(huán)境友好型催化劑。此外，一些小分子能夠作為介體擴(kuò)展漆酶的底物譜，這使得漆酶在有機(jī)污染物治理方面具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力[11]。已有研究表明，基于漆酶的生物修復(fù)技術(shù)[12-13]可以有效去除環(huán)境中的多環(huán)芳烴、抗生素、染料等污染物?，F(xiàn)有的研究主要集中在固定化漆酶技術(shù)以及水體中污染物的去除，直接利用漆酶降解土壤中有機(jī)污染物的研究還相對匱乏。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建了一株能產(chǎn)出高活力漆酶的重組里氏木霉菌株 (-)[14]，本研究在此基礎(chǔ)上利用幾種特定微生物構(gòu)建了新型秸稈降解菌劑，將秸稈快速降解與污染土壤生物修復(fù)過程進(jìn)行有機(jī)耦合，利用微生物在秸稈基質(zhì)中發(fā)酵生產(chǎn)的酶曲實(shí)現(xiàn)秸稈的快速降解；同時對土壤中的有機(jī)污染物進(jìn)行高效降解，從而實(shí)現(xiàn)土壤修復(fù)。

2 實(shí)驗(yàn)(材料與方法)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 菌種

重組里氏木霉，主要產(chǎn)出漆酶和纖維素酶，帶有來自血紅密孔菌()的耐高溫漆酶基因，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，保存在PDA斜面培養(yǎng)基上。

彩絨革蓋菌()，主要產(chǎn)出漆酶；黑曲霉()，主要產(chǎn)出半纖維素酶。它們均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種[15]。

2.1.2 有機(jī)物污染土壤的預(yù)處理

有機(jī)物污染土壤取自浙江杭州郊區(qū)某農(nóng)田，于通風(fēng)條件下自然風(fēng)干，篩選剔除雜質(zhì)后研碎備用。利用高效液相色譜測定不同污染土壤的有機(jī)污染物含量，其中毒死蜱污染土壤中毒死蜱含量為52.4 mg×kg-1、土霉素污染土壤中土霉素含量為73.7 mg×kg-1、2,4,5-三氯酚污染土壤中2,4,5-三氯酚含量為59.7 mg×kg-1。

2.1.3 試劑

毒死蜱乳油購自江西農(nóng)喜作物科學(xué)有限公司，鹽酸土霉素購自上海吉至生化科技有限公司，2,4,5-三氯酚購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

2.2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂粉20。

彩絨革蓋菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖10，酵母粉1，(NH4)2SO41.4，KH2PO42，CaCl20.4，尿素0.3，MgSO4·7H2O 0.2，C6H8O7·H2O 10.5，NaOH 3.9，CoCl20.0037，ZnSO40.0014，MnSO40.0016，F(xiàn)eSO40.005。

固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)液：(NH4)2SO410，尿素2，KH2PO42，CuSO40.1。

注：以上數(shù)值單位均為g×L-1。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：氨水處理后的水稻秸稈80 g×100 g-1干重，麩皮20 g×100 g-1干重，此外另加固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)液250 mL。

2.3 水稻秸稈的氨水預(yù)處理方法

水稻秸稈取自浙江紹興郊區(qū)。將水稻秸稈切成5～10 cm的小段，按照每g秸稈配10 mL氨水加入10 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氨水，在25～30 ℃室溫下浸泡24 h，抽濾并淋洗以除去秸稈中的殘留氨，烘干后保存?zhèn)溆?。?jīng)氨水預(yù)處理的水稻秸稈中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為49.1 %、21.5 %和12.4 %。

2.4 秸稈降解菌劑接種方法

首先將彩絨革蓋菌以培養(yǎng)5 d的種子液形式接入發(fā)酵基質(zhì)，重組里氏木霉和黑曲霉則以孢子懸浮液 (每mL含107個孢子)的形式分別延后1 d和2 d接入，接種比例為彩絨革蓋菌:重組里氏木霉:黑曲霉=2:2:1，總接種量為10 %(每mL配10 g基質(zhì))。

2.5 秸稈降解與有機(jī)物污染土壤生物修復(fù)的耦合過程試驗(yàn)

在11 cm×16 cm×5 cm的長方體生物反應(yīng)器內(nèi)，加入500 g、厚度約為10 cm的污染土壤以及200 mL自來水(預(yù)濕潤土壤)，同時鋪上25 g、4～5 cm厚的秸稈基質(zhì)，接入新型秸稈降解菌劑，于自然條件(平均氣溫25～30℃)下培養(yǎng)，每天分3次共補(bǔ)加45 mL清水以維持秸稈基質(zhì)的濕度。定時取樣檢測秸稈基質(zhì)中的菌種產(chǎn)酶、秸稈降解以及土壤中污染物降解情況。

2.6 秸稈和土壤的取樣以及預(yù)處理方法

秸稈取樣和預(yù)處理：秸稈的取樣采用五點(diǎn)法，即取對角線的交點(diǎn)以及對角線上距交點(diǎn)距離相同的四個點(diǎn)，每個點(diǎn)取等量秸稈，混合后加入pH為4.8的檸檬酸緩沖液浸泡24 h，離心過濾，取上清液測定三種酶的活力，并對秸稈殘?jiān)M(jìn)行組分分析。

土壤取樣和預(yù)處理：土壤的取樣也采用五點(diǎn)法，每個點(diǎn)取等量的表層土壤，混合風(fēng)干后碾成粉末備用。

2.7 分析測定方法

2.7.1 漆酶活力測定[15]

漆酶活力測定采用2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazo line-6-sulfonic acid)，ABTS) 法。以ABTS為底物，取50 μL酶液，加入950 μL、pH=4.0的檸檬酸緩沖溶液，與1 mL 2 mmol·L-1的ABTS 溶液混合后在30℃下反應(yīng)2 min，利用分光光度計(jì)測定420 nm下吸光值隨時間的變化。每分鐘消耗1 μmol ABTS的酶量定義為一個漆酶活力單位 (IU×mL-1或 IU×g-1)。

2.7.2 濾紙酶活力測定[16]

濾紙酶活力(filter paper activity，F(xiàn)PA)可用來表征纖維素酶總活力。以Whatman No.1濾紙為底物 (1 cm×6 cm)，加入1.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃下水浴反應(yīng)30 min后采用3,5-二硝基水楊酸(DNS) 法測定還原糖含量。每分鐘生成1 μmol葡萄糖 (以還原糖計(jì)) 所需的酶量定義為一個濾紙酶活力單位 (IU×mL-1或 IU×g-1)。

2.7.3 木聚糖酶活力測定[17]

取0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2 %的木聚糖底物，50℃下水浴反應(yīng)30 min后測定還原糖含量?？瞻自囼?yàn)中除酶液事先滅活外，其余條件不變。每分鐘分解底物釋放出1 μmol木糖 (以還原糖計(jì))所需的木聚糖酶量定義為一個木聚糖酶活力單位 (IU×mL-1或 IU×g-1)。

2.7.4 水稻秸稈成分分析[18]

纖維素含量測定：準(zhǔn)確稱取1 g樣品(記作1)于250 mL 磨口錐形瓶中，加入25 mL 體積分?jǐn)?shù)為20 %的硝酸乙醇溶液后安裝回流冷凝管，在沸水浴中加熱1 h，隨后進(jìn)行真空抽濾，保留濾渣至原錐形瓶中，重復(fù)操作至纖維變白。反應(yīng)結(jié)束后再次進(jìn)行真空抽濾，先用體積分?jǐn)?shù)為20 %的硝酸乙醇溶液洗滌濾渣，再用熱水洗滌至甲基橙洗液不顯酸性，最后用10 mL無水乙醇洗滌，濾渣于105℃下烘干至恒重 (記作2)。纖維素含量由式(1)計(jì)算得到。

半纖維素含量測定：準(zhǔn)確稱取0.50 g樣品 (記作)于250 mL三口燒瓶中，加入10 g NaCl和100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12 %的鹽酸，三個口分別與冷凝器、50 mL分液漏斗與溫度計(jì)相連，160℃下甘油浴中加熱，控制蒸餾速度為3 mL×min-1，不斷補(bǔ)加30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的鹽酸直至餾出液達(dá)350 mL，用濕醋酸苯胺試紙檢驗(yàn)餾出液中糠醛含量，待糠醛蒸餾完畢后將餾出液全部轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的鹽酸進(jìn)行定容。隨后移取100 mL至500 mL磨口錐形瓶中，加入250 g冰，待液體溫度降至0℃后加入25 mL溴化鉀-溴酸鉀溶液，避光放置5 min后加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 % 的KI溶液，搖勻后再放置5 min，隨后用0.1 mol×L-1硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。臨近滴定終點(diǎn)時加入2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 %的淀粉溶液，待藍(lán)色褪去后記錄滴定體積，記作1，mL。另取100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12 %的鹽酸溶液，重復(fù)操作，記錄滴定體積，記作2，mL。半纖維素含量由式(2)計(jì)算得到。

木質(zhì)素含量測定：準(zhǔn)確稱取1 g樣品 (記作3)于索氏抽提器中，加入250 mL乙醇-苯混合液，沸水浴中加熱抽提3 h，風(fēng)干后將樣品移至燒杯中，加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72 %的硫酸溶液，充分?jǐn)嚢韬笥?0℃水浴中放置2.5 h，隨后用300 mL蒸餾水分多次洗滌至500 mL錐形瓶中，安裝回流冷凝管并于沸水浴中加熱 2 h，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行真空抽濾，用熱水洗滌濾渣至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的CaCl2洗液不渾濁，105℃下烘干至恒重(記作4)。木質(zhì)素含量由式(3)計(jì)算得到。

2.7.5 土壤中土霉素提取及土霉素檢測[19]

土壤中土霉素提?。喝? g土壤樣品于棕色瓶中，加入10 mL浸提劑 (0.1 mol×L-1、pH為4.7的檸檬酸緩沖液)，超聲20 min，在轉(zhuǎn)速為3 000 r×min-1的離心機(jī)中離心15 min，取上清液，利用高效液相色譜檢測土霉素含量。

土霉素檢測：取樣品1 mL過0.45 μm水膜，利用高效液相色譜儀 (Agilent 1200, USA) 進(jìn)行檢測。流動相：0.01 mol×L-1草酸水溶液、乙腈、甲醇體積比為7:2:1，色譜柱為Eclipse XDB-C18 (150 mm×4.6 mm×5 μm)，流速為0.8 mL×min-1，柱溫為30℃，檢測波長為355 nm，進(jìn)樣量為20 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。降解率由式(4)計(jì)算得到。

式中：0為初始土霉素濃度，mg×kg-1；1為降解后土霉素濃度，mg×kg-1。

2.7.6 土壤中毒死蜱提取及毒死蜱檢測[20]

土壤中毒死蜱提?。喝⊥翗? g置于250 mL具塞三角瓶中，加入10 mL混合提取液 (丙酮、磷酸和水體積比為98:1:1)，振蕩提取1 h。用鋪有兩層定性濾紙的布氏漏斗抽濾，并用10 mL丙酮分3次洗滌濾渣和濾瓶，將濾液轉(zhuǎn)移至250 mL平底燒瓶中，40 ℃水浴中減壓濃縮至約5 mL。將濃縮液移至50 mL分液漏斗并加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %的NaCl溶液，用10 mL石油醚分2次提取。棄去水相，合并石油醚相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干 (水浴溫度45 ℃)，冷風(fēng)吹干，加入甲醇定容，用于高效液相色譜測定。

毒死蜱檢測：利用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，以甲醇-水溶液為流動相(甲醇、水體積比為85:15)，采用Eclipse XDB-C18色譜柱，流速為1.0 mL×min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長為290 nm，進(jìn)樣量為20 μL。采用外標(biāo)法定量。

2.7.7 土壤中2,4,5-三氯酚提取及2,4,5-三氯酚檢測

土壤中2,4,5-三氯酚提?。喝⊥寥罉悠? g置于圓底燒瓶中，以正己烷為提取液，使用索氏提取儀提取4 h，將殘留物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至2 mL左右，使用無水硫酸鈉去除水分，經(jīng)甲醇適當(dāng)稀釋后用于高效液相色譜測定。

2,4,5-三氯酚檢測：利用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，以甲醇-水溶液為流動相(甲醇、水體積比為85:15)，采用Eclipse XDB-C18色譜柱，流速為1.0 mL×min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為220 nm，進(jìn)樣量為20 μL。采用外標(biāo)法定量。

圖1 耦合過程中發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)程

圖2 耦合過程中秸稈降解進(jìn)程

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 耦合過程中秸稈的降解進(jìn)程

3.1.1 產(chǎn)酶進(jìn)程

接種的秸稈降解菌劑中包含的菌種具備高效產(chǎn)出漆酶、纖維素酶和半纖維素酶能力，在自然條件下能快速生長同時產(chǎn)出高活力酶，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖可見，發(fā)酵初期，隨著菌種在基質(zhì)中的蔓延生長，基質(zhì)中三種酶的活力也迅速提高。漆酶活力在第10 d達(dá)到峰值，為25.31 IU×g-1；濾紙酶活力和木聚糖酶活力分別在第8 d和第12 d達(dá)到峰值，分別為240.44和4 537.16 IU×g-1。秸稈主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，纖維素酶、木聚糖酶和漆酶分別作用于這三個組分，能夠使基質(zhì)中的水稻秸稈快速降解。在耦合過程的后期，三種酶的活力都開始呈下降趨勢，一方面是由于菌種產(chǎn)酶速率減小，另一方面也是由于酶蛋白向土壤中不斷滲漏。

3.1.2 秸稈降解進(jìn)程

接入的菌劑在固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的高活力的復(fù)合酶系有利于實(shí)現(xiàn)秸稈的快速降解。耦合過程中秸稈失重率與秸稈各組分降解情況如圖2所示。由圖可見，隨著基質(zhì)中酶的活力迅速上升，發(fā)酵初期秸稈中的纖維素被快速降解，發(fā)酵8 d降解率就達(dá)到了65.78 %、第12 d降解率高達(dá)75.4 %；半纖維素的降解率略高于纖維素，到第12 d降解率達(dá)到77.33 %。

發(fā)酵過程中分泌的漆酶對秸稈中的木質(zhì)素具有明顯降解作用。木質(zhì)素是一種高度交聯(lián)的芳香族雜聚物，它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和無規(guī)律性導(dǎo)致其難以降解[21]。漆酶是一種木質(zhì)素解聚酶，可以使木質(zhì)素解聚、改性，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素降解[22]。由圖2可見，在漆酶作用下，木質(zhì)素逐漸降解，到第12 d降解率達(dá)到32.35 %。漆酶對木質(zhì)素的降解對于耦合過程具有重要意義，它不僅提高了秸稈的協(xié)同降解效果，而且在木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的一些小分子酚類物質(zhì)還可以作為漆酶的介體[8]。木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)常見的有丁香醛、香草醛、乙酰丁香酮等，研究表明，這些小分子物質(zhì)不僅能像人工合成介體一樣提高漆酶的降解能力，同時具有成本低廉、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)；在某些方面天然介體還具有比人工合成介體更好的表現(xiàn)，是優(yōu)良的人工合成介體在未來應(yīng)用中的替代品[23-25]。

由圖2可見，隨著秸稈各主要組分的降解，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中的秸稈被迅速消耗，發(fā)酵第8 d，秸稈的失重率就達(dá)到了51.3%，到第12 d失重率可達(dá)到60.19%。

3.2 耦合過程中含土霉素土壤的生物修復(fù)進(jìn)程

按照2.4節(jié)所述方法，將秸稈鋪在含土霉素的土壤上方，接入秸稈降解菌劑后，定時取樣檢測秸稈基質(zhì)中的漆酶活力以及土壤中土霉素含量變化，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖可見，在發(fā)酵前期，基質(zhì)之中的漆酶活力隨著發(fā)酵進(jìn)行不斷上升，到第8 d漆酶活力達(dá)到了峰值，為19.72 IU×g-1。第8 d開始菌種生長繁殖減緩、產(chǎn)酶效率降低，同時酶不斷向土壤中滲漏，基質(zhì)中的漆酶活力開始呈下降趨勢。土霉素降解與漆酶的活力呈正相關(guān)，隨著漆酶活力逐步提高，土霉素被快速降解。在第8 d土霉素降解率就達(dá)到了84.24 %、第12 d達(dá)到93.4 %，與對照組相比降解速度大大提升。第8 d開始，土壤中的土霉素降解速度開始變緩，一方面是因?yàn)槠崦富盍ο陆凳箍傮w降解效率降低，另一方面是因?yàn)橥撩顾卮蟛糠忠呀?jīng)被降解、土壤中的土霉素變少，這也是降解速度變緩的重要原因。

抗生素在畜牧業(yè)中被廣泛使用，而且相當(dāng)比例的抗生素不能被動物吸收利用，會隨著動物糞便進(jìn)入環(huán)境、污染土壤。已有研究表明，漆酶也對磺胺類抗生素有很高的降解效果[26]。由此，本研究所采用的方法也適用于其他多種抗生素污染的土壤，具有良好的應(yīng)用前景。

圖3 耦合過程中漆酶活力變化及土壤中土霉素降解進(jìn)程

圖4 秸稈基質(zhì)中漆酶活力的變化及土壤中毒死蜱的降解進(jìn)程

圖5 秸稈基質(zhì)中漆酶活力的變化及土壤中2,4,5-三氯酚的降解進(jìn)程

3.3 耦合過程中含毒死蜱土壤的生物修復(fù)進(jìn)程

為了研究耦合過程對含有其他污染物的土壤修復(fù)效果，將耦合過程應(yīng)用于毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖可見，漆酶活力在第8 d達(dá)到最高值，為20.14 IU×g-1，之后急速下降。而漆酶活力變化趨勢則與土壤中毒死蜱降解率的變化規(guī)律密切相關(guān)，漆酶活力高毒死蜱降解率也高。前10 d，在漆酶作用下，土壤中的毒死蜱逐漸被降解；10 d后，毒死蜱降解速度開始放緩；到第12 d，土壤中的毒死蜱降解率達(dá)到了62.34 %，與對照組相比高了8倍多。但與土霉素污染土壤相比，毒死蜱污染土壤中毒死蜱降解率相對較低，說明本研究所使用方法對土壤修復(fù)效果與污染物種類有較大關(guān)系。

毒死蜱作為使用量巨大的有機(jī)磷農(nóng)藥，其對土壤造成的污染已引起環(huán)保工作者的高度關(guān)注。WANG等[27]利用固定化漆酶降解土壤中的毒死蜱，雖然取得了明顯的降解效果，但該工藝成本太高、難以實(shí)際應(yīng)用。本研究所采用的方法簡便、易行，不僅實(shí)現(xiàn)了秸稈的快速降解，而且還可使土壤中的毒死蜱得到有效降解，具有良好的推廣應(yīng)用價值。

3.4 耦合過程中含2,4,5-三氯酚土壤的生物修復(fù)進(jìn)程

本實(shí)驗(yàn)還探究了耦合過程對含2,4,5-三氯酚的土壤生物修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)時天氣轉(zhuǎn)冷，氣溫 25 ℃左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由于氣溫降低，使得發(fā)酵過程中產(chǎn)酶速率變慢、產(chǎn)酶進(jìn)程延后，漆酶活力在第12 d才達(dá)到最大值18.87 IU×g-1。在漆酶作用下，土壤中的2,4,5-三氯酚逐漸被降解，第4～8 d降解速度最快，第8 d時2,4,5-三氯酚降解率達(dá)到了52.26 %、第12 d達(dá)到65.21 %。而在對照組土壤中2,4,5-三氯酚幾乎沒有降解。

值得注意的是，第10～12 d，2,4,5-三氯酚仍然保持著不低的降解速度，這說明降解過程沒有停止，延長時間可得到更高降解率，因此，在后續(xù)工作中可通過延長耦合過程或者多輪耦合過程來提高有機(jī)污染物的降解率，提高土壤修復(fù)效果。

Lisov等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系里添加1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HBT)作為介體可以有效提高漆酶對多氯酚的作用效果，但HBT這種人工合成介體價格較高，同時有可能會對土壤環(huán)境造成二次污染，所以在實(shí)際應(yīng)用中有很大局限。本研究中，由于秸稈木質(zhì)素在降解過程中會產(chǎn)生一些小分子酚類物質(zhì)，它們可以作為天然介體可促進(jìn)漆酶對2,4,5-三氯酚的降解，所以無需外加人工合成介體也能獲取得較高降解率。利用耦合過程中形成的漆酶/天然介體系統(tǒng)進(jìn)行污染土壤修復(fù)是一個非常值得大力拓展的研究課題。

4 結(jié) 論

采用由重組里氏木霉、彩絨革蓋菌和黑曲霉所組成的復(fù)合菌系，將秸稈高效降解與污染土壤修復(fù)過程進(jìn)行有機(jī)耦合，耦合過程中，微生物利用秸稈基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵可生成高活力纖維素酶、木聚糖酶和漆酶，使秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素被加速降解，接種后第12 d秸稈失重率可達(dá)到60.19 %。同時，固態(tài)發(fā)酵過程中生成的漆酶又可以降解土壤中的土霉素、毒死蜱、2,4,5-三氯酚等多種有機(jī)污染物，耦合過程第12 d，土壤中的土霉素、毒死蜱、2,4,5-三氯酚降解率分別可達(dá)到93.4%、62.34 %和65.21 %。研究結(jié)果表明，將秸稈快速降解過程與污染土壤修復(fù)過程有機(jī)結(jié)合是一條經(jīng)濟(jì)、安全、有效的新途徑。

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Study on the coupling process of straw degradation and soil bioremediation

YANG Bin-bin1, XIA Ying2, XIA Li-ming1

(1. Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China;2. College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Rational utilization of straw resources and soil remediation are hot research topics. The coupling process of straw degradation and bioremediation of soil organic pollutants was studied. The contaminated soil was covered with rice straw which was inoculated with specific strains for solid fermentation. After 12 days of fermentation, laccase activity, filter paper activity (total cellulase activity) and xylanase activity were 25.31, 240.44 and 4 537.16 IU×g-1, respectively. The degradation rates of cellulose, hemicellulose and lignin reached 75.4%, 77.33% and 32.35%, respectively, and the weight loss rate of straw was 60.19%. During the coupling process, degradation rates of oxytetracycline, chlorpyrifos and 2,4,5- trichlorophenol in the soil on the 12thday were 93.4 %, 62.34% and 65.21%, respectively. This study can provide guidance for the rapid degradation of straws and the bioremediation of soil organic pollutants.

decomposition of straw; soil remediation; coupling; filter paper enzyme; laccase; xylanase; organic pollutant

1003-9015(2021)05-0927-08

Q814.9

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.05.021

2020-12-28；

2021-03-31。

國家自然科學(xué)基金(21676247)。

楊彬彬(1996-)，男，浙江衢州人，浙江大學(xué)碩士生。通信聯(lián)系人：夏穎，E-mail：yingxia@zjut.edu.cn