葉建斌，齊曉娜，張婷婷，孫福艷，楊宗燦，王高杰，張 展，艾 丹，劉文召，馮穎杰*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州 450016）

煙草浸膏是卷煙重要的香原料，可以提高煙草主體香氣，賦予卷煙更為自然、飽滿的香氣量，有效彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)一些煙葉香味不足、特征香氣不突出的缺點(diǎn)[1-2]。通過(guò)對(duì)物理或化學(xué)法制備的煙草浸膏的研究表明[3-5]，這類煙草浸膏的香味成分基本來(lái)源于煙葉原料，香型特征一般受制于原料的種類。因此，此類煙草浸膏還無(wú)法滿足各企業(yè)的針對(duì)性需求。此外，卷煙中添加煙草浸膏后，雖然香氣量和勁頭有所提升，但由于煙堿的增加，煙氣對(duì)喉部的刺激感也有所增加。因此，如何制備一種既可提供新型香氣，又能解決煙堿對(duì)喉部刺激的煙草浸膏成為本領(lǐng)域亟須解決的技術(shù)難題。

近年來(lái)，生物產(chǎn)香技術(shù)在食品和煙草加工領(lǐng)域的應(yīng)用研究有不少報(bào)道。一些微生物或酶用于釀造、調(diào)味品、功能飲料、煙草等食品領(lǐng)域發(fā)酵后可產(chǎn)生讓人喜悅的特征性香味[6-8]，利用生物酶或微生物發(fā)酵技術(shù)處理煙草原料制備煙草浸膏的研究也有報(bào)道[9-12]。這些研究證實(shí)了酶或微生物在輔助制備特色煙草浸膏方面具有廣闊的應(yīng)用前景，而尋找開(kāi)發(fā)特色的生物材料是成功制備煙草浸膏的關(guān)鍵。

“紅茶菌”是一種民間傳統(tǒng)功能性茶飲料，其中包含有酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等益生菌。乳酸菌和酵母菌常用于煙草加工，以提升煙草原料的內(nèi)在品質(zhì)[13-15]。另外，發(fā)酵成熟的“紅茶菌”液中含有活的有益微生物，又含有其代謝產(chǎn)物，如茶多酚、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、D-葡萄糖二酸-1，4內(nèi)酯等，可賦予良好的醫(yī)療保健功能[16]。應(yīng)用紅茶菌菌種進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，微生物自身生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可產(chǎn)生豐富的酶系，可能會(huì)分解轉(zhuǎn)化原料中某些成分而生成新的活性物質(zhì)，同時(shí)植物浸出物作為誘導(dǎo)物可刺激菌體產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，最終會(huì)使發(fā)酵液活性提高[17]。鑒于“紅茶菌”中的醋酸桿菌在發(fā)酵后可產(chǎn)生一定量的酸性物質(zhì)，而酵母和乳酸菌發(fā)酵煙草原料可以產(chǎn)生香氣物質(zhì)，作者利用紅茶菌發(fā)酵煙草浸提液，以期制備一種特色的酸香型煙草浸膏。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 紅茶菌：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，磷酸二氫鈉4 g，檸檬酸 1.15 g，去離子水定容至1 L，121℃滅菌 10 min。

1.1.2 煙末與煙絲 煙末：收集自黃金葉生產(chǎn)制造中心某牌號(hào)卷煙退出煙末；試驗(yàn)煙絲：黃金葉品牌二類卷煙葉組配方。

1.1.3 試劑 聚乙氧基月桂醚：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；二氯甲烷：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；乙酸苯乙酯：優(yōu)級(jí)純，北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；酒石酸鉀鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；次氯酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水楊酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 流動(dòng)分析儀（AutoAnalyzer3）：德國(guó)布朗盧比公司產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890-5975C）：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；恒溫恒濕箱 （KBF240）：德國(guó)Binder公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52AA）：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；氨基酸分析儀（Biochrom 30）：大昌華嘉商業(yè)有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀（1260 Infinity ELSD）：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水式真空泵（SHL-D）：北京凱亞儀器有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)（Hicen FR）：德國(guó)英雄實(shí)驗(yàn)儀器公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 紅茶菌種子制備 作者所在實(shí)驗(yàn)室保存的紅茶菌混合菌種在無(wú)菌環(huán)境下按接種體積分?jǐn)?shù)6%接種于種子培養(yǎng)基中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)4 d。

1.2.2 優(yōu)質(zhì)煙草浸膏制備工藝流程 煙草浸提液滅菌后接種紅茶菌種子液，根據(jù)紅茶菌特性[17-18]設(shè)置轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度30℃振蕩培養(yǎng)6 d。離心、過(guò)濾取上清液，70℃減壓濃縮至密度為（1.200±0.005）g/cm3，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇后放置于-20℃沉降24 h，離心取上清液，55℃減壓濃縮至密度為（1.200±0.005） g/cm3，得到優(yōu)質(zhì)煙草浸膏。

1.2.3 煙末水提優(yōu)化

1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取一定量煙末按照比例與去離子水混合，恒溫水浴提取，離心后得到煙草浸提液。

A 為按照料液質(zhì)量體積比（g∶mL）分別為 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，60 ℃浸提2 h，檢測(cè)提取率和總糖質(zhì)量濃度；

B為料液質(zhì)量體積比 （g∶mL）為1∶12，分別在30、40、50、60、70、80、90、99 ℃下浸提 2 h，檢測(cè)提取率和總糖質(zhì)量濃度；

C 為料液質(zhì)量體積比（g∶mL）為 1∶12，在 60 ℃下分別提 取 15、30、60、90、120、180、240、300 min，檢測(cè)提取率和總糖質(zhì)量濃度。

綜合考慮提取率和總糖質(zhì)量濃度，確定最佳料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間。浸提液提取率：煙末提取前烘干稱質(zhì)量記為W0，煙末提取后烘干稱質(zhì)量記為W1，浸提液離心后沉淀烘干稱質(zhì)量記為W2，浸提液提取率R=（W0-W1-W2）/W0。 浸提液總糖質(zhì)量濃度：連續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)[19]。

2）響應(yīng)面法對(duì)水提條件的優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken原理，以料液比（A）、浸提溫度（B）和浸提時(shí)間（C）為自變量，提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。應(yīng)用Design Expert10軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸及方差分析，確定各個(gè)因素的顯著性。

表1 因素水平Table 1 Factor levels

1.2.4 香味成分分析

1）前處理 量取1 g發(fā)酵后的煙草浸膏加入10 mL二氯甲烷中，并加入質(zhì)量濃度為1.032 mg/mL的乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)，常溫振蕩混合1 h，靜置后

2）GC-MS分析條件 色譜柱：DB-5MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm） ；進(jìn)樣溫度：250 ℃；分流比：5∶1；延遲：5 min；載氣：He；載氣流量：1 mL/min；升溫程序：50℃（1 min） 以 5℃ /min升至 250℃（5 min）；傳輸線溫度：270℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：35～600 AMU；圖譜庫(kù)：NIST11。

1.2.5 感官評(píng)價(jià) 參比卷煙為黃金葉未加香加料卷煙，以未加任何香料的卷煙為空白（CK），未經(jīng)發(fā)酵的煙草浸膏（其余步驟和條件與紅茶菌發(fā)酵后的煙草浸膏的制備方法完全相同）添加的卷煙作為對(duì)照（T0），加入紅茶菌發(fā)酵的煙草浸膏的卷煙為試驗(yàn)組（T1）。煙草浸膏添加量為50 μg/g，混勻后于溫度22℃、濕度65%環(huán)境中平衡48 h，卷制成卷煙。對(duì)卷煙進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，總共11個(gè)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)滿分5分，滿分55分，空白統(tǒng)一要求按照3分打，總計(jì)33分。共7位評(píng)委打分，對(duì)所有評(píng)委評(píng)分計(jì)算平均分?；诶走_(dá)圖的感官質(zhì)量評(píng)價(jià)步驟如下：1）評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)前期處理，包括數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和數(shù)據(jù)變換；2）繪制雷達(dá)圖；3）利用雷達(dá)圖綜合評(píng)價(jià)法對(duì)卷煙感官質(zhì)量進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。倒入分液漏斗，取有機(jī)相。重復(fù)萃取5次，合并有機(jī)相，經(jīng)旋蒸濃縮至體積為2～5 mL之間，測(cè)量濃縮后體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙末水提條件優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 浸提物含量的多少直接影響后續(xù)制備煙草浸膏的品質(zhì)，其中浸提率和糖質(zhì)量濃度是考察浸提效果的兩個(gè)重要指標(biāo)。作者對(duì)浸提料液比、浸提時(shí)間和溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1-3。隨著料液質(zhì)量體積比的降低，煙末浸提率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。在料液質(zhì)量體積比為1∶12時(shí)，提取率為31.66%，糖質(zhì)量濃度為9.86 g/L，之后隨浸提率上升，提取率和糖質(zhì)量濃度提升不明顯。由于含水量的增加，浸提液中糖質(zhì)量濃度整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。料液質(zhì)量體積比過(guò)高，煙末提取率低，料液質(zhì)量體積比過(guò)低則導(dǎo)致糖質(zhì)量濃度降低。另外，浸提液中過(guò)高的含水量會(huì)提高后期濃縮成本。因此，綜合考慮浸提率和工藝成本，可選擇1 g∶12 mL作為最佳料液比。

圖1 料液質(zhì)量體積比對(duì)浸提效果的影響Fig.1 Influence of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency

圖2 浸提溫度對(duì)浸提效果的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on extraction efficiency

圖3 浸提時(shí)間對(duì)浸提效果的影響Fig.3 Influence of extraction time on extraction efficiency

進(jìn)一步考察浸提溫度對(duì)浸提效果的影響，可以看出，隨著溫度的升高，浸提率和糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。浸提溫度低于60℃時(shí)，糖質(zhì)量濃度上升幅度較高。浸提溫度為60℃時(shí)，提取率為52.33%，糖質(zhì)量濃度為11.16 g/L。在溫度為60～90℃區(qū)間隨著溫度升高，糖質(zhì)量濃度增加不明顯。綜合考慮浸提成本和浸提效果，選擇60℃為最優(yōu)浸提溫度。

隨著浸提時(shí)間的增加，提取率和糖質(zhì)量濃度呈逐漸上升的趨勢(shì)。浸提時(shí)間在0～2 h時(shí)，提取率和糖質(zhì)量濃度增加明顯。浸提時(shí)間為2 h時(shí)，提取率高達(dá)55.34%，糖質(zhì)量濃度為13.14 g/L。之后隨著浸提時(shí)間的增加，糖質(zhì)量濃度緩慢增加，提取率保持穩(wěn)定，故浸提時(shí)間2 h為最優(yōu)。綜上，料液比和浸提時(shí)間對(duì)浸提效果的影響較大，浸提溫度對(duì)浸提效果的影響較小。

2.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 以料液質(zhì)量體積比、浸提溫度和浸提時(shí)間為自變量，以提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定3種不同因素對(duì)提取效率的影響程度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significant test

由表3可知，模型的 P值小于 0.05，表明該模型回歸顯著；失擬項(xiàng) P值為0.748 198＞0.1，表明該項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，該實(shí)驗(yàn)方法可靠。該模型的決定系數(shù)R2=0.933 7，表明模型在93.37%程度上能夠解釋提取率與變量之間的關(guān)系。對(duì)提取率進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合分析，可得到Y(jié)（提取率）對(duì)A（浸提時(shí)間）、B（料液比）、C（浸提溫度）的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=45.87-0.47A+0.42B-0.12C+0.18AB+0.19AC+0.17BC-1.81A2-1.43B2+0.15C2。

為了更加直觀地觀察各因素間的交互作用，利用Design-Expert軟件做出回歸方程中交互的響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖 4（a）—（c）。 可以看出，3 個(gè)因素對(duì)提取率影響的先后順序?yàn)榻釙r(shí)間、料液質(zhì)量體積比、浸提溫度。因此，嚴(yán)格控制浸提時(shí)間和料液比是保證水提效果的關(guān)鍵。運(yùn)行軟件的期望函數(shù)優(yōu)化程序，以提取率達(dá)到最大值為目標(biāo)，獲得優(yōu)化水提工藝參數(shù)為：浸提時(shí)間1.823 5 h、料液質(zhì)量體積比（g∶mL）1∶12.156、浸提溫度 60 ℃，預(yù)測(cè)提取率可達(dá)到46.209 7%，見(jiàn)圖4（d）?？紤]到實(shí)際操作的局限性，選取浸提時(shí)間 2 h、料液質(zhì)量體積比（g∶mL）1∶12、浸提溫度60℃為最優(yōu)水提條件，這一結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證了單因素實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的結(jié)果。

圖4 響應(yīng)面優(yōu)化確定煙草浸提最優(yōu)條件Fig.4 Optimal conditions for tobacco extraction were determined by response surface optimization

2.2 煙草浸膏香味成分分析

以上述最優(yōu)條件下浸提獲得的煙草浸提液為底物，利用紅茶菌進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)果表明：經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后，煙草浸膏香味成分的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加明顯。其中，香味物質(zhì)種類由39種增加到70種（表格未全列出），部分特征性香味物質(zhì)列于表4。

表4 煙草浸膏發(fā)酵前后主要香味成分變化Table 4 Changes of main aroma components of tobacco extract before and after fermentation

與未發(fā)酵煙草浸膏相比，大部分酸類香味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵浸膏中顯著增加。其中苯乙酸發(fā)酵后質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到141.95 μg/g，苯乙酸具有香葉和玫瑰樣的香氣，而且天然存在于煙草中，因此常作為煙用香精[20]。發(fā)酵后還新增了3-甲基丁酸、乳酸、丁二酸、戊二酸、2-甲基己酸等有機(jī)酸，有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高可以有效緩解煙堿對(duì)喉部的刺激感。其中乳酸帶有輕微的酸氣和味道，在煙草中常用作調(diào)味劑，可提調(diào)香氣，改善刺激性和辛辣雜味；3-甲基丁酸能在煙草制品中增添酒味、水果和乳酪樣甜香味道。丁二酸、2-甲基己酸、香草酸等都是國(guó)標(biāo)允許的煙用或食用香料，有利于提升煙草品質(zhì)[20]。此外發(fā)酵后的煙草浸膏中還增加了高級(jí)脂肪酸，如9，12-十八碳二烯酸、α-亞麻酸、硬脂酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加到 22.45、24.72、36.24 μg/g。 這些酸性物質(zhì)的提高可能與紅茶菌中的醋酸桿菌及乳酸菌發(fā)酵相關(guān)。之前有研究表明，具有香氣的煙葉，酸性組分含量高；缺乏香氣的煙葉，酸性組分含量低。因此，通過(guò)紅茶菌發(fā)酵后的煙草浸膏是一種具有酸香特征煙用香料。

另外，巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、麥芽酚等煙草特征香味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有所增加，發(fā)酵后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：31.54、20.17、5.83、6.30 μg/g。巨豆三烯酮有甜潤(rùn)而又持久的煙草樣香氣和干果香氣，具有煙草香和辛香底蘊(yùn)，是煙草中重要的香味成分。β-大馬酮具有濃而甜潤(rùn)的花香，在煙草中能使卷煙香氣甜醇，改善粗劣氣，增加天然感和厚實(shí)感。β-紫羅蘭酮有紫羅蘭花香氣，在卷煙中可以增強(qiáng)清甜香韻。麥芽酚具有甜香味的增效作用，能與煙草香味諧和，使煙氣吸味有柔和醇厚的口感[20]。2，3-丁二醇、1-（2-呋喃基）乙二醇、1-羥基-2-丙酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，分別增加592.45%、686.67%、172.67%。2，3-丁二醇可以賦予煙氣清香，羥基丙酮可以使煙氣更加柔順、賦予煙氣酒香。發(fā)酵后新增α-苯甲基-苯乙醇、3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭酮等香氣物質(zhì)，都是可以明顯提高煙草酸香氣息和果香嗅香的重要香氣物質(zhì)。研究結(jié)果表明，浸提液發(fā)酵后香味物質(zhì)明顯增多，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物增加，推測(cè)紅茶菌發(fā)酵浸提液可以促進(jìn)美拉德反應(yīng)的發(fā)生。已知美拉德反應(yīng)是在中性和微酸性條件下進(jìn)行的[21-23]，而紅茶菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸，正好提供酸性環(huán)境。

2.3 卷煙感官評(píng)價(jià)

對(duì)制備的卷煙進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)吸結(jié)果計(jì)算平均分，見(jiàn)表5。CK為空白組，T0為對(duì)照組（添加未發(fā)酵煙草浸膏），T1為實(shí)驗(yàn)組（添加發(fā)酵煙草浸膏）。由表5可知，加入紅茶菌發(fā)酵得到的煙草浸膏后，雜氣減輕，潤(rùn)感提升，香氣質(zhì)、香氣量、回甜、余味等均有提高。

表5 卷煙評(píng)吸結(jié)果平均值Table 5 Average value of cigarette smoking evaluation results

以上述數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過(guò)雷達(dá)圖進(jìn)一步分析卷煙感官質(zhì)量的改進(jìn)。從圖5可看出，CK的濃度較高，其余各指標(biāo)明顯低于T0和T1，香氣質(zhì)、香氣量等指標(biāo)較低，其感官質(zhì)量較差。T0的大部分指標(biāo)高于CK，但低于T1，其中余味、勁頭、刺激性等指標(biāo)較低。T1各指標(biāo)值較為接近，可見(jiàn)其指標(biāo)比較協(xié)調(diào)，其感官質(zhì)量要優(yōu)于其他兩個(gè)樣品。為了比較各樣品間感官質(zhì)量指標(biāo)的差異大小，根據(jù)圖5計(jì)算出雷達(dá)圖的特征量。雷達(dá)圖面積為 S，邊長(zhǎng)平方和為L(zhǎng)。3個(gè)卷煙樣品雷達(dá)圖S和L的值分別為：

圖5 樣品感官質(zhì)量評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.5 Radar chart of sensory quality evaluation of sample

樣品 CK的 S=2.284，樣品 T0的 S=4.078，樣品T1的 S=11.797；樣品 CK 的 L=11.323，樣品 T0的 L=17.907，樣品 T1的 L=48.255。

3 結(jié) 語(yǔ)

利用紅茶菌發(fā)酵煙草浸提液，經(jīng)濃縮制備酸性特征煙草浸膏，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，開(kāi)展浸膏香味成分分析并應(yīng)用于卷煙進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，得到結(jié)論如下：

1）優(yōu)化結(jié)果顯示，煙末水提的最優(yōu)條件為料液質(zhì)量體積比（g∶mL）1∶12，60 ℃恒溫提取 2 h，煙草浸提液提取率和含糖質(zhì)量濃度可分別達(dá)到55.34%、13.14 g/L；

2）經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后，浸提液中酸性香味成分的種類和含量增加明顯，巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、麥芽酚等煙草特征香味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有提高；

3）紅茶菌發(fā)酵制備得到的煙草浸膏具有酸香性質(zhì)，將其添加到卷煙中，香氣質(zhì)、香氣量等均有提高，并明顯優(yōu)于未發(fā)酵煙草浸膏。