王海宏，鄭 琦，顏偉強，岳 玲，戚文元，陳志軍，包英姿，孔秋蓮*

（1.上海市農業(yè)科學院，上海201106；2.上海束能輻照技術有限公司，上海201401）

食源性致病菌可導致食源性疾病和食物中毒，是影響食品安全的最主要原因。據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球腹瀉病例每年高達1.5億，其中70%與食品污染致病微生物有關，我國致病性微生物污染導致的疾病在食源性疾病中占比高達46.4%[1]。食源性致病菌多達幾十種，在我國食源性致病菌監(jiān)測中常見的有蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、創(chuàng)傷弧菌、阪崎腸桿菌等，在熟肉制品、即食豆制品、焙烤食品、中式涼拌菜、牛乳、盒飯等方便即食類食品中多有檢出[2-7]。

為保障食品安全，必須對食源性致病菌進行控制。我國2013年發(fā)布的《食品安全國家標準食品中致病菌限量（GB 29921—2013）》中規(guī)定了肉制品、水產制品、糧食制品、豆類制品、果蔬制品、飲料及冷凍飲品、即食調味品共8大類即食食品的致病菌的限量標準。除金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌按三級采樣方案允許有一定檢出外，沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7均要求無檢出[8]。方便即食類食品的安全性是第一需求，殺菌除蟲是食品安全的關鍵技術環(huán)節(jié)，是延長食品保質期、保證食品食用安全的必不可少的措施。傳統(tǒng)熱殺菌是保持食品安全和貨架期的主要技術，但熱加工易導致食品過度熟化和維生素等營養(yǎng)物質損失。非熱加工技術是一種相對新興的技術，在加工中產品溫升很低，對食品的感官和營養(yǎng)品質影響小，可避免食品色、香、味、質構的改變及營養(yǎng)損失。電子束輻照作為一種安全衛(wèi)生、低碳高效的非熱殺菌除蟲技術，在控制食源性疾病、殺滅有害昆蟲方面具有獨特優(yōu)勢，還可降低一些食品γ-射線加工的不良反應，能最大限度保持其原有的色、香、味，是不適于高溫滅菌的冷凍、冷藏類食品加工的理想滅菌除蟲技術。

研究證明，電子束能殺滅0157：H7大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬、李斯特氏菌屬等食源性致病菌以及食物致腐微生物，在食品安全領域有良好應用前景[9]。1.5 kGy電子束輻照可殺滅鮮切哈密瓜接種的沙門氏菌[10]；2 kGy電子束輻照可殺滅牛肉香腸中接種的沙門氏菌，產品感官特性未受到顯著影響[11]；3 kGy電子束輻照后，方便曲奇面團中接種大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌均無檢出，面團的色澤和質構較未輻照處理未出現顯著差異[12]；6 kGy電子束輻照可有效殺滅散裝即食醬鹵牛肉的大腸菌群和金黃色葡萄球菌[13]。輻照殺滅微生物的有效性受微生物輻射耐受性和微生物數量的影響，微生物的耐受性越強、數量越多，殺滅微生物需要的輻照劑量越高。鮮切果蔬等食品因品質保持需求，對輻照劑量有一定的限制要求，實際生產中輻照劑量較低。而亞致死的低劑量輻照作為一種外加的逆境刺激，可能引起微生物的應激反應，從而影響輻照效果。目前關于低劑量電子束處理對食源性致病菌生長影響還少見報道，作者以常見食源性致病菌大腸埃希氏菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌為對象，研究亞致死劑量電子束輻照對微生物生長的影響，以期為電子束輻照在食源性疾病控制中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、大腸埃希氏菌ATCC25922：購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；單核細胞增生李斯特氏菌BNCC336877：購自商城北納創(chuàng)聯生物科技有限公司；蠟樣芽孢桿菌B10：購自上海市工業(yè)微生物研究所菌種保藏中心；培養(yǎng)基：購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 供試菌液制備

鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌冷凍甘油保藏菌種復蘇，TSB培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)過夜，PCA培養(yǎng)基劃線接種，35℃培養(yǎng)48 h得到單菌落，挑取單菌落再次在TSB培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)過夜增菌，控制菌量在107水平，得到供試菌液。

1.3 輻照處理

1.3.1 致病菌輻照D10值 設定劑量為 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 kGy共6個水平，每個劑量水平設置3次重復。供試菌液加入無菌的一次性平板，每個平板10 mL菌液，加蓋后用封口膜纏繞封口，電子束單面輻照，根據菌液可培養(yǎng)菌落數量計算D10值。

1.3.2 多次輻照的致病菌輻照D10值 供試菌液加入無菌的一次性平板，每個平板10 mL菌液，加蓋后用封口膜纏繞封口，電子束單面輻照，輻照劑量設定 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 kGy 共 6 個水平，每個劑量水平設置3次重復。同樣操作重復3次，得到多次亞致死劑量輻照的病原菌供試菌液，根據菌液可培養(yǎng)菌落數量分別計算每次輻照的D10值。

1.3.3 亞致死劑量輻照對致病菌生長曲線和生物被膜形成的影響 供試菌液加入無菌的一次性平板，每個平板10 mL菌液，加蓋后用封口膜纏繞封口。根據致病菌D10值，選擇亞致死的劑量輻照供試菌液，電子束單面輻照，輻照劑量設定0、2 kGy，每個劑量水平設置3次重復，每個重復10個平板。

1.3.4 亞致死劑量輻照對病原菌混合菌中百分比的影響 將大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌供試菌液等比例混合，制備混合供試菌液?；旌瞎┰嚲杭尤霟o菌的一次性平板，每個平板10 mL菌液，加蓋后用封口膜纏繞封口。根據致病菌D10值，選擇亞致死的劑量輻照供試菌液，電子束單面輻照，輻照劑量設定0、2 kGy，每個劑量水平設置3次重復。

以上所有輻照利用清華同方威視IS1020電子加速器（10 MeV、20 kW）進行，使用重鉻酸銀液體化學劑量計對實際輻照劑量進行監(jiān)測[14]，劑量計的校準按照GB/T 16640—2008進行[15]。

1.4 方法

1.4.1 致病菌輻照D10值的計算 D10值是指將微生物總數降低一個數量級的輻照劑量，通過不同輻照劑量對應的致病菌可培養(yǎng)數量的對數值，建立線性擬合方程y=ax+b，D10值即為a的倒數的絕對值，其中：y為輻照劑量；x為致病菌可培養(yǎng)數量的對數值；a、b 為常數。

1.4.2 生長曲線測定方法 參考王蒙蒙方法稍做改動[16]。供試菌液5 000 r/min離心5 min，得到微生物菌體沉淀，用無菌生理鹽水清洗沉淀后再離心，重復一次，將菌體沉淀用TSB培養(yǎng)基懸浮，控制菌量為102mL-1水平。采用12孔板測定，每個孔板加入菌液4 mL，35℃下靜置培養(yǎng)，定期監(jiān)測A600nm值，同時進行PCA平板菌落計數。

1.4.3 生物被膜測定方法 供試菌液于5 000 r/min離心5 min，得到微生物菌體沉淀，用無菌生理鹽水清洗沉淀后再離心，重復一次，將菌體沉淀用TSB培養(yǎng)基懸浮，控制菌量為102CFU/mL水平。采用12孔板測定，每個孔板加入菌液4 mL，35℃下靜置培養(yǎng)7 d，使用結晶紫染色法[17]測定生物被膜。

1.4.4 混合菌百分比分析方法 將處理后的混合供試菌液立即進行PCA平板菌落計數，同時將混合供試菌液5 000 r/min離心5 min，得到微生物菌體沉淀，用無菌生理鹽水清洗沉淀后再離心，重復一次，將菌體沉淀用原體積的TSB培養(yǎng)基懸浮，再用TSB培養(yǎng)基適當稀釋，調整菌量為102CFU/mL水平，35℃培養(yǎng)過夜后平板計數檢測。大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌分別采用伊紅美藍瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂、改良Mc Bride瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎平板計數，分析各菌種百分比。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照幾種食源性致病菌的致死劑量分析

D10值是指將微生物總數降低一個數量級的輻照劑量，數值大小可反映微生物對射線的耐受能力，是輻照加工工藝中選擇適宜滅菌劑量的重要參數[18]。從表1以看出，蠟樣芽孢桿菌的D10值最高，其后依次是單核細胞增生李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，大腸埃希氏菌的D10值最低，表明同樣含量水平條件下，電子束輻照食源性致病菌的致死劑量要求由高到低依次為蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌。

表1 4種食源性致病菌電子束輻照D10值Table 1 D10values of four foodborne pathogens irradiated by electron beam

2.2 多次輻照對食源性致病菌致死劑量的影響

輻照可殺滅微生物，引起可培養(yǎng)微生物數量大幅下降，同時作為一種逆境刺激，輻照可導致未被殺死的微生物產生損傷修復。研究表明，微生物主要通過快速修復受損的DNA片段、形成芽孢減緩新陳代謝速率、產生超氧化物歧化酶清除自由基等途徑來降低輻照損傷[19]。輻照損傷修復可影響微生物對輻照的耐受特性。由圖1可以看出，食源性病原菌電子束輻照的D10值隨輻照次數增加而降低，降低幅度因病原菌種類和輻照次數不同而不同，其中第二次輻照時D10值下降幅度最大，不同病原菌之間以蠟樣芽孢桿菌下降幅度最大，大腸埃希氏菌下降幅度最小。第三次輻照時不同種類病原菌的D10值趨于一致，菌間差異大幅減小。

圖1 多次輻照對4種食源性病原菌D10值的影響Fig.1 Effect of multiple irradiation on D10values of four foodborne pathogens

2.3 亞致死劑量電子束輻照對4種致病菌生長曲線的影響

生長曲線的測定有助于了解菌株的生長及代謝情況。由圖2可以看出，35℃下食源性致病菌生長曲線表現為接種后至4 h時 處于延遲期，4～12 h處于對數生長期，12～32 h處于穩(wěn)定期，菌落的數量最高到108～109CFU/mL水平。電子束亞致死劑量輻照影響食源性致病菌的對數生長期的開始階段，在同樣2 kGy劑量處理下，大腸埃希氏菌的對數生長期明顯滯后于對照處理，原因可能在于其較低的D10值。亞致死劑量輻照還影響食源性致病菌穩(wěn)定期的菌落數量級水平，2 kGy劑量處理下，食源性致病菌穩(wěn)定期的菌落數量級水平低于對照，其中沙門氏菌與對照的差別最大，蠟樣芽孢桿菌與對照的差別最小。在25℃和15℃較低溫度下培養(yǎng)時，食源性致病菌的生長呈緩慢增加趨勢，25℃下60 h、15℃下84 h時對照處理的菌落數量級與35℃培養(yǎng)時的水平接近，2 kGy輻照處理的菌落數量級水平低于對照，其中15℃下2 kGy處理的菌落數量級明顯低于未輻照處理，見圖3～4。另外，5℃下培養(yǎng)時所有處理基本都無生長。

圖2 35℃下亞致死劑量的食源性致病菌生長曲線Fig.2 Growth curve of foodborne pathogens irradiated by sublethal dose at 35℃

圖3 25℃下亞致死劑量的食源性致病菌生長曲線Fig.3 Growth curve of foodborne pathogens irradiated by sublethal dose at 25℃

圖4 15℃下亞致死劑量的食源性致病菌生長曲線Fig.4 Growth curve of foodborne pathogens irradiated by sublethal dose at 15℃

2.4 亞致死劑量電子束輻照對4種致病菌生物被膜形成的影響

生物被膜是致病菌控制中較難解決的問題，生長環(huán)境條件的變化對生物被膜的形成有著重要影響[17]。由圖5可知，4種致病菌的生物被膜形成能力有較大差異，單核細胞增生李斯特菌成膜能力最強，其次是大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌成膜能力最低。亞致死劑量電子束輻照對4種致病菌的生物被膜形成有明顯影響，但其效果因致病菌種類而異，大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌的生物被膜形成量在亞致死劑量電子束輻照后有所增加，而單核細胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌則表現為降低。統(tǒng)計分析結果表明，電子束輻照對4種致病菌生物被膜形成的影響均為極顯著水平，見表2。

圖5 輻照對4種食源性致病菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effect of irradiation on biofilm formation of four foodborne pathogens

表2 電子束輻照后4種食源性致病菌生物被膜形成量的差異分析Table 2 Difference analysis of biofilm formation of four foodborne pathogens after electron beam irradiation

2.5 亞致死劑量電子束輻照對4種致病菌數量比的影響

為探討不同食源性致病菌共存時的競爭，研究了鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌混合菌液的菌種數量比，見圖6。首先通過稀釋度控制和添加量控制保持菌混合液中各食源性致病菌占比基本一致，即0 kGy-0 h處理各菌數量比控制在23%～26%。混合菌液經2 kGy亞致死劑量輻照后，2 kGy-0 h處理的各菌數量比有較大變化，蠟樣芽孢桿菌最高，其后依次是單核細胞增生李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，大腸埃希氏菌最低，與其輻照D10值表現一致。經過35℃、18 h培養(yǎng)后，各食源性致病菌的占比發(fā)生變化，未輻照處理0 kGy-18 h各菌數量比差別不大，由高到低依次為鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌；2 kGy輻照處理2 kGy-18 h表現為大腸埃希氏菌最低，其次是蠟樣芽孢桿菌，其中亞致死劑量處理的蠟樣芽孢桿菌占比從培養(yǎng)前的33.49%下降至25.06%，其他3種致病菌百分比都較培養(yǎng)前有所增加，表明輻照后的蠟樣芽孢桿菌在混合菌液中生長受到抑制。

圖6 輻照對4種食源性致病菌的數量比例的影響Fig.6 Effect of irradiation on the percentage of four foodborne pathogens

3 結 語

輻照作為一種逆境處理，對食源性致病菌的殺滅作用受到病原菌自身輻射耐受特性和環(huán)境條件的影響，D10值是反映微生物對射線耐受能力的指標[18]，是輻照加工中劑量確定的主要參數，在產品微生物污染水平確定的條件下，D10值越高，微生物輻射耐受性越強，殺滅微生物的劑量要求就越高[18]。D10值在食品輻照加工業(yè)研究報道較多[20-21]，為實現工藝目的，食品輻照加工中允許將所需的全部吸收劑量分多次進行照射[22]，而有關多次電子束輻照處理條件下D10值的變化少見報道。本研究表明，4種食源性致病菌中，蠟樣芽孢桿菌D10值最高，大腸埃希氏菌D10值最低，但不同致病菌D10值的差異在多次輻照條件下減小。多次輻照可引起致病菌的D10值下降，但其下降幅度并未隨輻照次數增加而增加，不同致病菌的下降幅度也有所不同，隨著輻照次數增加，各致病菌的D10值逐漸趨于接近。陳曉明等研究枯草芽孢桿菌輻射耐受性，從不同劑量1次中子輻照后的存活平板中隨機挑取菌落，擴大培養(yǎng)后再次進行不同劑量的中子和γ射線輻照，發(fā)現中子1次輻照后，能顯著提高中子和γ射線2次輻照殺死芽孢的能力[23]，與本文結果一致。

微生物的生長繁殖有一定規(guī)律性，可分為延遲期、對數期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段，其中延遲期在食品工業(yè)中具有重要的實際應用價值，人們可以根據控制外界環(huán)境條件來延長延遲期的時間，一旦度過延遲期，即標志著食品保質期的結束[24-25]。本研究表明，2 kGy輻照處理可延長致病菌的延遲期時間，其中15℃下2 kGy處理的菌落數量級明顯低于未輻照處理。研究也表明，加熱和輻照均可延長蠟樣芽孢桿菌生長延遲期，但加熱不影響存活細胞的比生長速率，而輻照降低了最大生長速率，且其降低幅度與劑量相關[9]，表明輻照處理的食品貨架期比熱處理長，對大腸菌群等食品中允許檢出的病原菌控制方面意義重大。

細菌生物被膜是細菌黏附于物體表面，因自身分泌多糖蛋白復合物等物質形成的聚集膜，對細菌菌體具有強烈的保護作用，因其特殊的立體多層結構導致可到達被膜內層細菌的抗菌劑濃度低、滲透時間長，耐藥性明顯大于浮游細菌[17]。研究表明，李斯特菌、沙門氏菌等常見致病菌均易形成生物被膜，多見于食品加工廠房的地板、天花板及加工設備、工業(yè)管道的內外表面，不僅損害設備，而且會污染食品，傳播食源性疾病[26]。不同種類致病菌的生物被膜形成能力有所差異，本研究條件下，單核細胞增生李斯特氏菌最強，鼠傷寒沙門氏菌最低。低劑量電子束輻照對4種食源性致病菌的生物被膜形成有極顯著影響，鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌成膜能力減弱，而大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌輻照后成膜能力增強，其機理和影響因子控制技術有待進一步研究。因此在食品原料和配料等產品的輻照加工中，劑量設定應該充分考慮相關因素。

輻照作為一種物理冷殺菌技術，已廣泛應用于食品及其配料產品的消毒滅菌，其對生鮮食品的食源性致病菌控制方面前景良好。已有研究表明，冷卻豬肉經0.5、1、2 kGy輻照后，腸桿菌科均受明顯抑制，其中0.5、1 kGy處理顯著低于對照，2 kGy處理極顯著低于對照，同時假單胞菌水平也顯著低于對照[27]。小麥粉3 kGy輻照時，蠟樣芽孢桿菌從55 CFU/g 下降至未檢出（＜10 CFU/g）[28]。 0.68～2.32 kGy劑量范圍內的輻照可有效控制鮮切圓生菜中的微生物而不影響其食用和感官品質，大腸菌群對數值為3.36時，1.46 kGy輻照處理4℃冷藏3 d時無檢出，4 d時低于15 CFU/g，可有效控制圓生菜的大腸菌群[29]。本研究從微生物生長抑制方面證明，電子束輻照處理對食源性致病菌具有良好的殺滅作用，低劑量處理即可有效抑制致病菌生長繁殖，對鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌的生物被膜形成還有極顯著抑制作用。因此，可考慮適宜劑量電子束輻照結合低溫等品質保持技術控制致病菌生長繁殖，降低致病菌的數量級水平，可有效延長產品貨架期、保障食品衛(wèi)生安全。