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        人源β-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I(hGnT-I)的原核表達(dá)與活性鑒定

        2021-11-12 14:00:52陸天天高曉冬
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        陸天天,王 寧,高曉冬

        (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122)

        哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中完成,N-糖鏈結(jié)構(gòu)依次經(jīng)高甘露糖型、雜合型、最后生成成熟形態(tài)的復(fù)合型糖鏈,該過(guò)程對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、半衰期和分子識(shí)別功能等具有關(guān)鍵作用[1]。β-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I(GnT-I)是N-糖鏈加工過(guò)程中的重要蛋白質(zhì),它是一個(gè)定位在高爾基體上的膜蛋白,功能為以UDPGlcNAc為供體,向M5GN2寡糖的核心五糖結(jié)構(gòu)中α1-3連接的甘露糖上添加一個(gè) β1-2連接的GlcNAc[2-3],該步驟是N-糖鏈由高甘露糖型向雜合型或復(fù)合型轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟[4-5]。

        人源 GnT-I(hGnT-I)由 445 個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量約為50 900,1990年成功篩選到其基因MGAT1[2]。GnT-I蛋白已經(jīng)成功在哺乳動(dòng)物細(xì)胞[2]以及大腸桿菌中完成可溶性表達(dá)[6-7],目前市售GnT-I來(lái)自Novus Biologicals公司[8],為哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系表達(dá)的可溶性GnT-I蛋白。但哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)量低,體系構(gòu)建昂貴,導(dǎo)致該商業(yè)蛋白質(zhì)產(chǎn)品價(jià)格很高,一定程度上阻礙了GnT-I的進(jìn)一步研究和技術(shù)開發(fā)。原核表達(dá)體系雖然蛋白質(zhì)產(chǎn)量高,但由于hGnT-I是帶有一個(gè)跨膜域的膜蛋白,采用原核系統(tǒng)表達(dá)可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)降解、形成包涵體、所表達(dá)蛋白質(zhì)無(wú)活性等問(wèn)題。現(xiàn)有報(bào)道中的原核表達(dá)案例,均在GnT-I上融合了一段較長(zhǎng)的蛋白質(zhì)標(biāo)簽,如Seki等人報(bào)道在該蛋白質(zhì)N端融合麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)以輔助其功能性表達(dá)與純化[7],雖然得到了具有活性的蛋白質(zhì),但大部分蛋白質(zhì)形成包涵體存在于沉淀里,大大降低了其應(yīng)用性。

        在本研究中,作者構(gòu)建了用于表達(dá)截除N端跨膜域的重組hGnT-I的質(zhì)粒,將其導(dǎo)入含有稀有密碼子的大腸桿菌Rosetta DE3菌株中進(jìn)行可溶性表達(dá),隨后優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件并對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行了活性研究。作者完成了重組hGnT-I大量功能性表達(dá)體系的建立,為進(jìn)一步研究該蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其在糖鏈合成中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)[9-10]。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌菌種Rosetta DE3和表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒:購(gòu)于德國(guó)Novagen公司;人基因組文庫(kù):購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;引物合成及基因測(cè)序:由華大基因完成。

        1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨 10 g/L,氯化鈉10 g/L,瓊脂粉 20 g/L(固體培養(yǎng)基),121℃滅菌20 min后備用;

        TB培養(yǎng)基:酵母提取物24 g/L,胰蛋白胨12 g/L,磷酸氫二鉀9.4 g/L,磷酸二氫鉀2.2 g/L,甘油4 mL/L,121℃滅菌20 min后備用。

        1.1.3 主要試劑 高速高保真PCR酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I和 Hind III、DNA Ligation Kit: 購(gòu)于日本TaKaRa公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG):購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;氯霉素、卡那霉素:購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司;鎳親和小柱(HisTrap HP,1 mL):購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司;免疫印跡檢測(cè)所用抗體Anti-His Mouse IgG和 Goat Anti-Mouse HRP:購(gòu)于碧云天生物技術(shù);熒光標(biāo)記的糖鏈M3GN2-Asn-Fmoc和GN2M3GN2-Asn-Fmoc:獲贈(zèng)于日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST);核苷酸單糖 UDP-GlcNAc:購(gòu)于青島曙格公司;β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶 (β-N-actylglucosiminidase S):購(gòu)于美國(guó)NEB公司;其他常用試劑均購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)。

        1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀 (Waters 2695)和熒光檢測(cè)器(Waters 2475):美國(guó)沃特世公司;色譜柱(Amide,150 mm×4.6 mm,3 μm):安捷倫科技有限公司;蛋白質(zhì)電泳以及免疫印跡轉(zhuǎn)移槽:美國(guó)伯樂(lè)公司。

        1.2 方法

        1.2.1 MGAT1基因的克隆及重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM的構(gòu)建 根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)人源MGAT1基因編碼序列,結(jié)合UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)GnT-I跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè),人源MGAT1基因編碼序列長(zhǎng)1 335 bp,前87 bp編碼一段面向胞質(zhì)的片段以及跨膜域,故從第88 bp開始設(shè)計(jì)PCR引物,并在5′端分別引入BamH I和Hind III酶切位點(diǎn),引物序列見(jiàn)表1。以人基因組文庫(kù)中包含MGAT1基因的單克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,得到目的基因片段。將目的基因和pET28a空載質(zhì)粒分別用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠回收后以20 ng目的基因、10 ng pET28a、5 μL Ligation Mix體系在25℃連接15 min后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)SOC培養(yǎng)基在37℃預(yù)培養(yǎng)45 min后,涂布于LB/Kan+/Cm+(卡那霉素50 μg/mL,氯霉素 34 μg/mL)平板上進(jìn)行篩選。 12 h后從平板挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,將檢定陽(yáng)性的單克隆擴(kuò)增并且提取質(zhì)粒,命名為pET28a-MGAT1ΔTM。

        表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

        1.2.2 重組hGnT-I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET28a-MGAT1ΔTM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于LB/Kan+/Cm+平板上,于37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落接種于5 mL LB/Kan+/Cm+(卡那霉素 50 μg/mL,氯霉素 34 μg/mL) 液體培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)12 h;后將培養(yǎng)基以1∶100體積比接入200 mL TB/Kan+/Cm+(抗生素質(zhì)量濃度同上)液體培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí),將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至16℃搖床冷卻1 h,加入終濃度為100 μmol/L的IPTG,16℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。表達(dá)完成后于4℃、9 000 g離心3 min,收集菌體,棄盡培養(yǎng)液后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 重組hGnT-I蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 以1.2.2重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)為背景對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8時(shí),降溫至16℃后,加入 100 μmol/L的 IPTG,分別在 0、2、4、6、8、10、12、16 h 對(duì)菌液進(jìn)行取樣,采用免疫印跡法對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);采用相同的方法表達(dá)蛋白質(zhì),加入不同濃度的 IPTG(10、50、100、200、500、1 000 μmol/L),培養(yǎng)10 h后對(duì)菌液進(jìn)行取樣,采用免疫印跡法對(duì)加入不同濃度誘導(dǎo)劑的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)。

        1.2.4 重組hGnT-I蛋白的純化 將冷凍保存的菌體置于冰水中解凍15 min,加入15 mL的重懸緩沖液 (25 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,pH 8.0)重懸菌體,超聲波破碎菌體10 min,于4℃、9 000 g離心45 min,收集上清液蛋白質(zhì)。將上清液用注射器上樣至用重懸緩沖液平衡的鎳親和層析小柱,并用含不同濃度咪唑(20、60、250 mmol/L)的重懸緩沖液洗脫,收集洗脫液,檢測(cè)目的蛋白質(zhì)。用30 000超濾離心管過(guò)濾含有重組hGnT-I(His-hGnT-IΔTM)蛋白的洗脫液,并加入25 mmol/L HEPES-NaOH(pH 7.4)洗滌3次,得到濃縮蛋白質(zhì)液,置于-80℃冰箱備用。

        1.2.5 重組hGnT-I蛋白的活性檢測(cè) 糖基化反應(yīng)(總體積 50 μL) 各組分如下:1 μmol/L M5GN2-Asn-Fmoc,0.1 mmol/L UDP-GlcNAc,10 mmol/L MgCl2,0.1 mg/mL His-hGnT-IΔTM 蛋白,50 mmol/L MES-NaOH(pH 6.0)。反應(yīng)體系在37℃下孵育1 h,18 000 g離心5 min,取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。流動(dòng)相 A:乙腈;流動(dòng)相 B:0.1 mol/L NH4OAc。梯度:0~5 min,85%B;5~35 min,85%~50%B;35~40 min,50%~30%B;40~45 min,30%~85%B。 熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)(ex):295 nm;發(fā)射波長(zhǎng)(em):315 nm;流量:1.0 mL/min;柱溫 40 ℃。

        1.2.6 重組hGnT-I蛋白的底物特異性檢測(cè) 底物特異性檢測(cè)時(shí),除將底物更換為M3GN2-Asn-Fmoc外[11],使用的反應(yīng)條件和檢測(cè)方法與活性檢測(cè)相同,其中考慮到非天然底物的特異性問(wèn)題,可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間。

        1.2.7 產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證 對(duì)1.2.5和1.2.6中的反應(yīng)體系進(jìn)行產(chǎn)物驗(yàn)證,方法如下:50 μL糖基化反應(yīng)體系于100℃加熱5 min,取44 μL與β-N-乙酰氨基葡糖苷酶[12](1 μL)和 10×GlycoBuffer(5 μL)混合,37℃孵育12 h,18 000 g離心5 min,取上清液用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 hGnT-I蛋白跨膜域結(jié)構(gòu)分析

        TMHMM跨膜域預(yù)測(cè)圖譜見(jiàn)圖1??梢钥闯?,hGnT-I在N端有一個(gè)跨膜域結(jié)構(gòu),結(jié)合UniPort蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的模擬預(yù)測(cè)可知,跨膜區(qū)域位于7~29位氨基酸,而1~6位氨基酸位于胞質(zhì)側(cè)。本研究設(shè)計(jì)截除前87 bp編碼1~29位氨基酸的序列,只表達(dá)包含高爾基體腔內(nèi)側(cè)可溶性片段的hGnT-IΔTM。

        圖1 hGnT-I蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 Predicted transmembrane domain of hGnT-I

        2.2 重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM的構(gòu)建

        表達(dá)質(zhì)粒選用多克隆區(qū)域前后都有6×His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET28a,在蛋白質(zhì)N端融合了一個(gè)6×His標(biāo)簽以進(jìn)行后續(xù)純化工作,重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM 見(jiàn)圖2。

        圖2 重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTMFig.2 Recombinant expression plasmid pET28a-MGAT1ΔTM

        2.2.1 基因的擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析,13 00 bp左右有明顯條帶,而截除前87 bp的目的基因MGAT1ΔTM片段長(zhǎng)度為1 248 bp,與預(yù)期大小一致,見(jiàn)圖3。

        圖3 MGAT1ΔTM目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳Fig.3 MGAT1ΔTM gene PCR amplification

        2.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM菌落PCR驗(yàn)證及測(cè)序 經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證,所得質(zhì)粒中至少3個(gè)單克隆擴(kuò)增出1 300 bp左右的目的片段,見(jiàn)圖4。挑取該3個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)增與質(zhì)粒提取和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與Genbank中去除前87 bp的MGAT1基因編碼區(qū)域一致,表明重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM構(gòu)建成功。

        圖4 pET28a-MGAT1ΔTM重組質(zhì)粒菌落PCR驗(yàn)證Fig.4 Colony PCR for pET28a-MGAT1ΔTM plasmid construction

        2.3 His-hGnT-IΔTM蛋白的表達(dá)與純化

        2.3.1 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta DE3中誘導(dǎo)12 h后,收集菌體進(jìn)行超聲波破碎,離心得到上清液;將上清液用鎳親和層析柱純化,收集含不同濃度咪唑(20、60、250 mmol/L)緩沖液的洗脫液。對(duì)不同蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析,結(jié)果見(jiàn)圖5。與未加入IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液相比,誘導(dǎo)后的樣品在42 800左右位置出現(xiàn)誘導(dǎo)前樣品未出現(xiàn)的條帶,表明重組hGnT-I蛋白可溶性表達(dá)成功,相對(duì)分子質(zhì)量約為42 800,產(chǎn)率為7.5 g/L,見(jiàn)圖5。

        圖5 重組蛋白His-hGnT-IΔTM的表達(dá)與純化Fig.5 Expression and purification of recombinant HishGnT-IΔTM protein

        經(jīng)過(guò)SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證,目的蛋白質(zhì)集中于含250 mmol/L咪唑的洗脫液中。將該部分洗脫液收集并用超濾離心管過(guò)濾濃縮,通過(guò)反復(fù)用HEPES-NaOH緩沖液清洗后得到終質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的重組hGnT-I蛋白。

        2.3.2 重組蛋白質(zhì)表達(dá)條件的優(yōu)化 收集不同誘導(dǎo)條件下的菌體進(jìn)行破碎裂解,直接將細(xì)胞裂解液作為樣品進(jìn)行免疫印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)程度,其中第一抗體為Mouse Anti-His IgG,第二抗體為Goat Anti-mouse IgG,HRP。結(jié)果表明,在誘導(dǎo)開始2 h后,蛋白質(zhì)開始逐漸表達(dá),直到10 h后表達(dá)量基本趨于一致,12 h后蛋白質(zhì)表達(dá)量不再變化;采用優(yōu)化過(guò)誘導(dǎo)時(shí)間10 h的進(jìn)一步對(duì)加入的誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,加入100 μmol/L IPTG比加入50 μmol/L可以使蛋白質(zhì)表達(dá)量成倍增加,然而加入更高濃度的誘導(dǎo)劑并不能提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量,見(jiàn)圖6。

        圖6 重組hGnT-I蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the expression condition of hGnT-I protein

        2.4 重組hGnT-I蛋白的性質(zhì)鑒定

        首先采用與天然底物類似的帶熒光標(biāo)簽的N-糖鏈M5GN2-Asn-Fmoc作為重組hGnT-I蛋白的底物,確認(rèn)了其體外活性,見(jiàn)圖7。Stanly等人也于1990年報(bào)道hGnT-I蛋白在體外可以識(shí)別M3GN2,因此也檢測(cè)了重組蛋白對(duì)非天然底物M3GN2-Asn-Fmoc的特異性,確認(rèn)其可以作為重組hGnT-I的反應(yīng)底物,見(jiàn)圖8。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切驗(yàn)證為目標(biāo)產(chǎn)物。

        圖7 重組hGnT-I蛋白對(duì)底物M5GN2-Asn-Fmoc的活性檢測(cè)Fig.7 hGnT-I protein activity against M5GN2-Asn-Fmoc

        圖8 重組hGnT-I蛋白對(duì)底物M3GN2-Asn-Fmoc的活性檢測(cè)Fig.8 hGnT-I protein activity against M3GN2-Asn-Fmoc

        2.4.1 重組蛋白質(zhì)活性檢測(cè) 以M5GN2-Asn-Fmoc為底物,體外糖基化反應(yīng)體系離心取上清液后進(jìn)行HPLC檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖7。反應(yīng)體系中推測(cè)的糖鏈產(chǎn)物GNM5GN2-Asn-Fmoc較起始底物M5GN2-Asn-Fmoc有明顯的偏移,間隔時(shí)間約1.2 min。說(shuō)明重組hGnT-I蛋白成功以UDP-GlcNAc為糖基供體、M5GN2-Asn-Fmoc為受體進(jìn)行了糖基化反應(yīng),生成了加上1個(gè)GlcNAc的產(chǎn)物糖鏈GNM5GN2-Asn-Fmoc,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為100%。

        2.4.2 重組蛋白底物特異性檢測(cè) 以M3GN2-Asn-Fmoc為底物經(jīng)過(guò)1 h或2 h反應(yīng),從圖8中可以看到,1 h反應(yīng)體系中除了底物糖鏈M3GN2-Asn-Fmoc以外,還出現(xiàn)了添加了1個(gè)GlcNAc的產(chǎn)物GNM3GN2-Asn-Fmoc,而在延長(zhǎng)孵育時(shí)間至2 h的樣品中則只能檢測(cè)到產(chǎn)物GNM3GN2-Asn-Fmoc。與標(biāo)準(zhǔn)糖鏈GN2M3GN2-Asn-Fmoc相比,該產(chǎn)物在HPLC中的洗脫時(shí)間較短,符合氨基柱以化合物極性大小正向洗脫的順序,說(shuō)明重組hGnT-I蛋白可以識(shí)別非天然底物M3GN2-Asn-Fmoc,但該酶促反應(yīng)的效率低于天然底物。

        2.4.3 反應(yīng)產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證 將反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)高溫滅活后,加入β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶,經(jīng)過(guò)12 h水解后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示,糖鏈產(chǎn)物GNM5GN2-Asn-Fmoc和GNM3GN2-Asn-Fmoc在糖苷酶的水解作用下,形成了未加上GlcNAc的底物M5GN2-Asn-Fmoc和M3GN2-Asn-Fmoc。該結(jié)果證明重組hGnT-I蛋白催化的糖基化反應(yīng)為向寡糖底物添加β糖苷鍵連接的N-乙酰葡糖胺。

        3 結(jié) 語(yǔ)

        作者成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM,利用大腸桿菌表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)了截除跨膜域的hGnT-I的大量可溶性表達(dá),并在鎳柱純化后對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行了體外活性測(cè)試。研究結(jié)果表明,該重組蛋白質(zhì)對(duì)天然底物類似物M5GN2-Asn-Fmoc和非天然底物M3GN2-Asn-Fmoc均具有活性。通過(guò)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證,證明糖基化產(chǎn)物為一個(gè)由β糖苷鍵連接的N-乙酰葡糖胺,說(shuō)明該重組蛋白質(zhì)的體外活性與體內(nèi)活性一致。本研究克服了人源膜蛋白在原核體系表達(dá)易降解、易失活的難點(diǎn),提供了大量獲得活性重組hGnT-I蛋白的方法,為進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)以及糖鏈酶法合成相關(guān)技術(shù)提供了新的方法。

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