傅 奇，甘美裕，王 艷，林俊杰，盧源欽，肖玉娟

（廈門華廈學(xué)院，福建 廈門 361024）

作為細(xì)菌鑒定最常用的方法，16S rDNA/RNA測序具有快速、簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但在部分類群中16S序列存在高度相似性，無法準(zhǔn)確定位到種[1]。尤其在芽孢桿菌屬中，由于種間序列高度相似，無法單獨(dú)依靠16S序列對菌種進(jìn)行鑒定，通常需要結(jié)合其他數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如通過3′端16S rDNA和5′端16S-23S ITS核苷酸序列結(jié)合構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行分類[2]，再結(jié)合 DNA 雜交進(jìn)行分析[3]；或 16S、gyrA、gyrB基因序列分別比對、建樹[4]。

蠟樣芽孢桿菌作為一種條件致病菌，可產(chǎn)生多種毒素，導(dǎo)致腹瀉或嘔吐[5]，是食品中的一類重要致病菌，施用動物肥的果蔬容易受污染。目前蠟樣芽孢桿菌主要通過生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，耗時較長，開發(fā)快速準(zhǔn)確的分子鑒定方法有助于縮短檢測周期。gyrB基因作為一種細(xì)菌中的常見保守序列，可編碼DNA促旋酶的B亞單位，進(jìn)化速度快于16S，可用于細(xì)菌的鑒定[6]。張慧娟等人采用gyrB與多個毒力基因結(jié)合進(jìn)行多重PCR進(jìn)行快速檢測，但其中特異性gyrB基因在部分蘇云金芽孢桿菌也呈擴(kuò)增陽性[7]。本研究利用16S序列與gyrB基因拼接序列聯(lián)合建樹，以較少的序列數(shù)和進(jìn)化樹數(shù)實(shí)現(xiàn)對篩選菌株的快速鑒定，提高數(shù)據(jù)的利用率，減少數(shù)據(jù)沖突，為芽孢桿菌種群的分子生物學(xué)鑒定方法開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣本 廈門同安國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)竹壩農(nóng)場采集，該種植區(qū)施用動物肥。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆羊血瓊脂培養(yǎng)基、動力-硝酸鹽培養(yǎng)基：購自青島海博生物科技有限公司。

1.1.3 PCR反應(yīng) 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；16S擴(kuò)增引 物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（F），5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′（R）；gyrB 擴(kuò) 增 引物 ：5′-ATTTGG CGCTGGCGGTTAT-3′（F），5′-GGTTTCGGCTGGGC TGGTA-3′（R）：購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 于農(nóng)場施用動物肥的蔬菜種植區(qū)采集土壤，取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理鹽水稀釋均質(zhì)后涂布營養(yǎng)瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h，取疑似芽孢桿菌的單菌落進(jìn)行劃線純化。

1.2.2 16S與gyrB序列提取 用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化菌株的總DNA；分別用16S與gyrB引物擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物電泳純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 16S與gyrB序列比對與進(jìn)化分析 將16S與gyrB基因測序所得結(jié)果在Genbank進(jìn)行比對。為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性，避免錯誤信息干擾，選擇Genbank中g(shù)yrB相似度前1 000個序列中的ATCC菌株進(jìn)行比對，且選擇16S與gyrB序列同時可得的菌株進(jìn)行比對。16S與gyrB基因序列用BioEdit[8]進(jìn)行比對，去除兩端不整齊序列，用ClustalX[9]進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換后，取有效區(qū)間拼接[10]，用Paup*4.0基于最大簡約算法，構(gòu)建拼接序列進(jìn)化樹[11-12]，選擇大腸桿菌ATCC 25922[13]作為外群。

1.2.4 生理生化驗(yàn)證 參考國標(biāo)《飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢測》[14]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[15]進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 聯(lián)合建樹方法適用性分析 為分析16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法是否適用于其他蠟樣芽孢桿菌的鑒定，于Genbank下載16S與gyrB基因均可得的蠟樣芽孢桿菌序列，按照上述方法進(jìn)行序列拼接。選擇《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[14]中芽孢桿菌屬模式菌株，于Genbak和和EZBiocloud下載16S和gyrB序列，選擇大腸桿菌ATCC 25922作為外群，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

從土壤中篩選得到一株革蘭氏陽性桿菌，菌落呈灰白色，細(xì)胞成鏈狀排列，編號為HX2016002。

2.2 16S與gyrB基因測序

PCR擴(kuò)增所得16S序列有效區(qū)共1 439 bp，gyrB序列有效區(qū)共1 386 bp。

2.3 序列比對與進(jìn)化樹構(gòu)建

16S序列比對結(jié)果中，高相似度菌株過多，且多數(shù)菌株無gyrB序列；而gyrB序列比對結(jié)果中，高相似菌株遠(yuǎn)少于16S比對結(jié)果，且多數(shù)菌株同時可獲取16S序列，因此，以gyrB相似菌株作為建樹群，其中ATCC菌株均為全基因組測序，因此16S與gyrB基因序列號相同，見表1。

表1 Genbank中擁有相似16S與gyrB序列的菌株Table 1 Strains in Genbank with similar 16S and gyrB sequences

16S和gyrB序列比對后去除頭尾不整齊片段，均保留中心區(qū)域1 335 bp，將同一菌株的16S與gyrB拼接后建樹，見圖1。計算次數(shù)為1 000，樹長為5 680，一致性指數(shù)（CI）為 0.685，保留指數(shù)（RI）為 0.754，同型指數(shù)（HI）為 0.315。

圖1 基于16S與gyrB合并序列的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on merged sequences of 16S and gyrB

全樹各分支自展值均高于96，表明該樹結(jié)構(gòu)可靠，其中HX2016002與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）聚為一支，自展值為100，表明其很可能為蠟樣芽孢桿菌菌株。

2.4 生理生化驗(yàn)證

HX2016002菌株接種至MYP瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h后菌落呈粉紅色，周圍有暈圈；接種至胰酪胨大豆羊血瓊脂，30℃培養(yǎng)24 h后，菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)；穿刺接種至動力-硝酸鹽培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后沿穿刺線呈擴(kuò)散生長；蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素染色試驗(yàn)呈陰性。確認(rèn)該菌株為蠟樣芽孢桿菌，與進(jìn)化分析結(jié)果一致，命名為 Bacillus cereus HX2016002。

2.5 聯(lián)合建樹方法適用性

在Genbank中選擇符合以下條件的蠟樣芽孢桿菌下載16S與gyrB序列：一是16S與gyrB序列均已上傳Genbank；二是鑒定結(jié)果較為可靠。共有滿足條件的菌株52株，另選擇親緣關(guān)系較近的芽孢桿菌屬其他菌種模式菌株15株，拼接16S與gyrB基因序列后構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖2。其中所有的蠟樣芽孢桿菌均聚合在一簇，表明如這52株菌中的任意一株菌種在還未鑒定的情況下，利用該方法建樹時與其他51株蠟樣芽孢桿菌均聚合在一支，可準(zhǔn)確鑒定為蠟樣芽孢桿菌。16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法適用于已知的52株蠟樣芽孢桿菌鑒定，可以預(yù)測該方法在蠟樣芽孢桿菌鑒定中具有普適性。

圖2 Genbank已知菌株基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S and gyrB in Genbank

3 結(jié) 語

芽孢桿菌是生活中常見也是非常重要的一類微生物，研究人員經(jīng)常需要對其中的某一個或多個菌株進(jìn)行鑒定，而分子生物學(xué)鑒定具有快速、簡便且準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的菌種鑒定手段，但芽孢桿菌之間保守序列的高度相似性為分子生物學(xué)鑒定帶來了困擾，往往需要對多個基因甚至全基因組進(jìn)行測序來定位到種。在研究過程中，本課題組先通過16S序列將菌株定位至芽孢桿菌分類簇，設(shè)計gyrB引物擴(kuò)增、測序后縮小比對范圍。同時，為了保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，避免無效甚至錯誤數(shù)據(jù)，選擇ATCC保藏的菌株進(jìn)行分析。本課題組認(rèn)為，在單基因測序的基礎(chǔ)上，單純的增加測序基因數(shù)量并對多個基因分別比對和建樹的方法有時并不能提高鑒定的準(zhǔn)確性，甚至可能造成分析結(jié)果的紊亂和沖突，因此，選擇了16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方式進(jìn)行分析，將HX2016002準(zhǔn)確鑒定為蠟樣芽孢桿菌。經(jīng)驗(yàn)證，該方法在蠟樣芽孢桿菌的鑒定中具有較普遍的適用性，下一步將繼續(xù)研究該方法在其他保守序列相似度高的菌群鑒別中應(yīng)用的有效性。