李國秀 王晶金 高婷彥 鄭浩睿 唐 琳

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611100）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬植物，果實(shí)中富含大量的花色苷，具有抗氧化、抗衰老、降血脂等功效。

目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室花色苷提取的常用方法：有機(jī)溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和生物酶輔助提取法。雙水相萃取花色苷是近年隨著生物學(xué)的發(fā)展興起的一種新型提取方法。與常用方法相比，雙水相萃取花色苷具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如一步實(shí)現(xiàn)提取分離，提取條件溫和，經(jīng)濟(jì)節(jié)約等。在目前報(bào)道中，常使用水/乙醇/無機(jī)鹽雙水相系統(tǒng)萃取植物材料中的花色苷類物質(zhì)，花色苷傾向于向上相乙醇富集相分配，總糖類物質(zhì)傾向于向下相鹽富集相分配，從而達(dá)到提取分離目的。

常用花色苷提取方法輔助手段單一，本文采用超聲波與纖維素酶兩種輔助手段提取黑果枸杞花色苷。本文中雙水相萃取法使用的無機(jī)鹽硫酸銨與磷酸二氫鈉均為弱酸性鹽，與無水乙醇所形成的雙水相體系呈酸性，剛好符合花色苷在酸性條件下更加穩(wěn)定的特性。

目前關(guān)于黑果枸杞中花色苷的雙水相萃取研究鮮見報(bào)道；與常用提取方法相比，雙水相萃取黑果枸杞花色苷成分變化分析未見報(bào)道?；谘芯楷F(xiàn)狀，本文以花色苷含量、多糖去除率、花色苷色價(jià)和花色苷成分分析為指標(biāo)多方面比較雙水相萃取和超聲酶輔助提取花色苷的效果。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

以青海地區(qū)的黑果枸杞為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院白潔副教授鑒定為茄科枸杞屬黑果枸杞。

纖維素酶(成都瑞芬思公司)；AB-8大孔樹脂(上海紫銘試劑廠)；乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、硫酸銨均為分析純(成都市科龍?jiān)噭┗S)；MS半微量電子精密分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；離心機(jī)H1850型(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；UV1600紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)（寧波市鄞州儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA型（上海亞榮生化儀器廠）；PH計(jì)（?，斂萍加邢薰荆籜500B Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀（SCIEX公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

黑果枸杞干果烘干，粉碎，過40目篩，備用。

1.2.2 超聲酶輔助提取黑果枸杞花色苷

1.00 g黑果枸杞粉末置于50 mL離心管中，依次加入25 mL 75%乙醇溶液、1.00 mg纖維素酶，用1% HCl(v/v)調(diào)節(jié)溶液pH為3.0，避光45℃超聲輔助提取30 min；使用高速離心機(jī)4000 rpm/min，離心20 min，收集上清；將上清用70%酸性乙醇溶液（pH3.0）定容至100 mL，即得提取液。

1.2.3 雙水相萃取黑果枸杞花色苷

一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無機(jī)鹽和去離子水加入50 mL離心管中，待無機(jī)鹽完全溶解后，再加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇，使得溶液體系的總質(zhì)量為48.00 g；1.00 g黑果枸杞粉末加入離心管中，45℃超聲輔助提取一定時(shí)間（乙醇/硫酸銨體系：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%，時(shí)間36 min。乙醇/磷酸二氫鈉體系：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，時(shí)間37 min）。超聲結(jié)束，4000 rpm/min，離心20 min，收集上下相溶液；將上下相溶液用70%酸性乙醇（pH=3.0）定容至100 mL，即得提取液。

1.2.4 總花色苷含量測定

花色苷含量的測定采用pH示差法：將提取液分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液稀釋10倍，在避光條件下平衡90 min。平衡結(jié)束，使用紫外分光光度計(jì)分別測定各提取液的平衡溶液在528 nm、710 nm波長下的吸光值。按以下公式計(jì)算所得黑果枸杞花色苷含量：花色苷含量(mg/g)=[(A528-A700)pH1.0-(A528-A700)pH4.5]×Mw×DF×V/(ε×L×m)，式中：Mw，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2 g/mol；DF—稀釋因子；V—提取液的體積，100 mL；E—摩爾消光系數(shù)，29600 L/(mol·cm)；L—光程厘米數(shù)，1 cm；m—黑果枸杞粉末的質(zhì)量，1.00 g。

1.2.5 花色苷色價(jià)測定

提取液在45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，-80℃冷凍干燥24 h，得到紫黑色黑果枸杞花色苷樣品。準(zhǔn)確稱取黑果枸杞花色苷樣品1.00 g，采用pH3.0的70%乙醇進(jìn)行稀釋一定倍數(shù)，在528 nm處測其吸光值，用以下公式計(jì)算黑果枸杞花色苷色價(jià)：E=A×DF/W。式中：E—花色苷色價(jià)；A—吸光度值；DF—稀釋倍數(shù)；W—黑果枸杞粉末質(zhì)量。

1.2.6 多糖去除率測定

采用苯酚-硫酸法測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y(吸光值)=71．266X(葡萄糖溶液濃度)+0.0301(R2=0.9982)。用以下公式計(jì)算多糖去除率：多糖去除率(%)=C下V下/(C上V上+C下V下)×100。式中：C上—上相中的總糖含量；C下—下相中的總糖含量；V上—上相溶液體積；V下—下相溶液體積。

1.2.7 花色苷的純化

1.2.7.1 花色苷樣品的準(zhǔn)備

提取液45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，-80℃冷凍干燥，得到花色苷粗品。

1.2.7.2 AB-8大孔樹脂純化

準(zhǔn)確稱取1.00 g花色苷粗品溶于100 mL的80%酸化純水中作為上樣液，純水用1% HCl預(yù)先調(diào)至pH3.0，控制流速為1.0 mL/min上樣。待上樣平衡后，用1% HCl調(diào)至pH3.0的80%乙醇溶液洗脫花色苷，待洗脫液開始有顏色時(shí)開始收集花色苷。對收集的花色苷純化樣品進(jìn)行45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后-80℃冷凍干燥，備用。

1.2.8 UPLC-QTOF-MS/MS質(zhì)譜分析花色苷成分

1.2.8.1 供試液的制備

取一定量“1.2.7.2”中得到的花色苷樣品溶于50%色譜甲醇(0.1%甲酸，v/v)中，12000 rpm/min，離心5 min，然后過0.22 μm濾膜，相同的操作反復(fù)3次。

1.2.8.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：采用X500B Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀的C18反 相 色 譜 柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流 動(dòng) 相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫條件為0-10 min，0%～20%B；10～15 min，20%～30%B；15～17 min，30%～95%B；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。質(zhì)譜條件：正離子模式檢出，離子源溫度500℃，m/z范圍50～1200，離子化電壓5500 V，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，氣簾氣30 psi。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí) 驗(yàn) 重 復(fù) 三 次，采 用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,USA)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(Mean±SD)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 基于花色苷含量比較

將超聲輔助雙水相萃取得到的花色苷含量與超聲酶輔助提取得到的花色苷含量進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)三種方法均能對黑果枸杞中的花色苷進(jìn)行有效提取。

表1 不同提取方法下花色苷含量對比Table 1 Comparison of color content of anthocyanins under different extraction methods

2.2 基于花色苷色價(jià)比較

表2 不同提取方法下花色苷色價(jià)對比Table 2 Comparison of color value of anthocyanins under different extraction methods

結(jié)果表明，兩種雙水相萃取得到的花色苷色價(jià)是超聲酶輔助法的2倍。這可能是因?yàn)樵陔p水相萃取過程中花色苷更傾向于上相水相中分配，多糖更傾向于下相無機(jī)鹽相中分配，這使得通過雙水相萃取得到的花色苷色價(jià)更高，意味著雙水相萃取的花色苷純度更高。

2.3 基于多糖去除率比較

乙醇/硫酸銨雙水相萃取花色苷可以除去90.62%的多糖，乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取可以除去82.16%的多糖。多糖被作為雜質(zhì)被除去后，花色苷的純度相應(yīng)的增加，這與色價(jià)的比較結(jié)果形成了相互印證。

2.4 花色苷成分分析

采用超聲酶輔助提取法和乙醇/硫酸銨、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法提取的花色苷粗提液經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化后，分別進(jìn)行UPLC-QTOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果見表3。在相同的色譜條件和質(zhì)譜條件下，相同的保留時(shí)間，三種提取方法下經(jīng)過大孔樹脂純化的花色苷均鑒定出了15種相同的花色苷。在其他保留時(shí)間下，未發(fā)現(xiàn)三種方法下提取的花色苷成分有差異。這說明了雙水相萃取相比超聲酶輔助法能夠完全保留黑果枸杞中的花色苷。

表3 花色苷成分分析Table 3 Analysis of anthocyanins

3.結(jié)論

本研究采用超聲酶輔助提取法和乙醇/硫酸銨、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法提取黑果枸杞中花色苷，基于花色苷含量、花色苷色價(jià)、多糖去除率、花色苷成分分析對花色苷提取效果進(jìn)行比較。

結(jié)果表明，雙水相萃取花色苷含量與超聲酶輔助法相比無顯著差別，但是純度提高了2倍。乙醇/硫酸銨雙水相萃取花色苷可以除去90.62%的多糖，乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取可以除去82.16%的多糖。在相同的色譜條件和質(zhì)譜條件下和相同的保留時(shí)間，三種提取方法下經(jīng)過大孔樹脂純化的花色苷均鑒定出了15種相同的花色苷。這說明了雙水相萃取相比超聲酶輔助法能夠完全保留黑果枸杞中的花色苷。

通過本文研究，與超聲酶輔助法相比，雙水相萃取法更加適用于花色苷的提取，為雙水相萃取黑果枸杞花色苷積累了基礎(chǔ)資料。