溫周瑞，許欽涵，盧伶俐，韓育章，劉可群，潘 宙

（1.湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所，武漢 430062；2.武漢區(qū)域氣候中心，武漢 430074；3.湖北省公安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村科技服務(wù)中心，湖北 公安 434399）

黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）隸屬鯰形目鲿科黃顙魚(yú)屬，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，黃顙魚(yú)暴發(fā)性疾病時(shí)有發(fā)生，2011年重慶榮昌地區(qū)黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)由維氏氣單胞菌引起的黃顙魚(yú)下顎點(diǎn)狀出血、鰭基充血、腹部膨大等癥狀的疾?。?］，2015年浙江省湖州市多家黃顙魚(yú)集約化養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)維氏氣單胞菌引起的黃顙魚(yú)“潰瘍綜合征”［2］，2017年湖北省荊州市黃顙魚(yú)主養(yǎng)區(qū)域也暴發(fā)維氏氣單胞菌引起的黃顙魚(yú)腹水征，導(dǎo)致黃顙魚(yú)大規(guī)模死亡［3］，類志賀鄰單胞菌能引起黃顙魚(yú)頭腹部及鰭部潰爛、出血、肝臟腫大［4］和在魚(yú)種階段因腹水病死亡等癥狀［5］。維氏氣單胞菌與類志賀鄰單胞菌均為黃顙魚(yú)常見(jiàn)致病菌，由于養(yǎng)殖過(guò)程中可能存在密度過(guò)高、水質(zhì)惡化、水溫變化劇烈和用藥不規(guī)范等問(wèn)題，導(dǎo)致這些致病菌越來(lái)越難防控。

2020年3—5月，中國(guó)部分地區(qū)相繼出現(xiàn)黃顙魚(yú)暴發(fā)性病害。湖北省武漢、荊州、宜昌、潛江等地池塘養(yǎng)殖的黃顙魚(yú)陸續(xù)暴發(fā)疾病并不同程度死亡，給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)部分地區(qū)黃顙魚(yú)病害流行情況進(jìn)行了調(diào)查，較全面分析發(fā)病原因，對(duì)發(fā)病黃顙魚(yú)致病菌進(jìn)行分離、純化、鑒定和藥敏試驗(yàn)，并結(jié)合調(diào)查結(jié)果提出防治對(duì)策，為同類型黃顙魚(yú)的病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)：病魚(yú)采自湖北省潛江市、公安縣黃顙魚(yú)主養(yǎng)池塘。

試劑：腦心浸液肉湯（BHI）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；瓊脂購(gòu)自Chembase 公司；藥敏試驗(yàn)96 孔板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離、純化與鑒定 取典型病魚(yú)，用酒精棉球擦洗體表。無(wú)菌條件下解剖魚(yú)體，迅速用接種環(huán)取肝、脾、腎等組織后接種于腦心浸液肉湯固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌株接種于腦心浸液肉湯固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。將純化后的菌株送至武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定種類。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 挑取純化后的單菌落于無(wú)菌生理鹽水中，制成0.5 個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙?。將制成的菌懸液用無(wú)菌生理鹽水稀釋100 倍后，加入藥敏板的所有微孔中（陰性對(duì)照除外），陰性對(duì)照每孔加入200 μL 的無(wú)菌生理鹽水，28 ℃培養(yǎng)24 h。

藥敏板采用微量肉湯稀釋法，每個(gè)孔有其對(duì)應(yīng)的藥物及濃度，從左往右藥物濃度依次降低。經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)（藥敏分析試劑板底清澈澄亮，同陰性對(duì)照）的微孔，其對(duì)應(yīng)最低藥物濃度即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 氣 象 要 素 2020年1月1日 至5月15日 公 安縣氣溫、降水記錄由湖北省氣象資料檔案室提供。24 小時(shí)變溫表示某日日平均溫度、日最高溫度、日最低溫度24 小時(shí)差值中最小值，具體計(jì)算如下：

式中，Ti、Txi、Tni分別表示第i天日平均溫度、日最高溫度、日最低溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情基本情況

2020年春季黃顙魚(yú)發(fā)病時(shí)間從3月中旬開(kāi)始，持續(xù)到5月中旬，高峰期在4月中下旬，發(fā)病范圍比較廣，發(fā)病率和死亡率比較高。湖北省公安縣黃顙魚(yú)套養(yǎng)和專養(yǎng)共800 hm2，其中，專養(yǎng)533 hm2基本上都發(fā)??；套養(yǎng)的267 hm2發(fā)病面積不到1%。調(diào)查某漁場(chǎng)，黃顙魚(yú)養(yǎng)殖面積93 hm2，發(fā)病面積占80%。黃顙魚(yú)死亡80%～90%的池塘面積占10%～20%，死亡30%～40%的占60%～70%。黃顙魚(yú)產(chǎn)量近1 500 kg/667 m2。發(fā)病規(guī)格20～100 g/尾。

患病魚(yú)主要癥狀：突然停食，游動(dòng)緩慢或靜臥池邊，瀕死魚(yú)離群獨(dú)游，反應(yīng)遲鈍，在水面打轉(zhuǎn)，頭朝上、尾朝下、懸垂于水面。病魚(yú)頭部發(fā)紅或發(fā)黑，頭吻部潰爛發(fā)白，有的“頭穿孔”，吻端、口腔、下頜部、鰓蓋充血，偶見(jiàn)鰓絲腫脹和少許黏液；表皮發(fā)黃，體表皮膚潰瘍、布滿黏液，背鰭基部、胸鰭基部、尾鰭有潰爛；有的魚(yú)腹部膨大，肛門紅腫，有的腹水嚴(yán)重，胃、腸內(nèi)無(wú)食物，有的胃充滿黏性積液，腸后段紅色、果凍樣；肝臟失血、脾臟發(fā)黑、腎臟腫大壞死、膽囊腫大。

2.2 天氣氣候影響

表1 是2020年1 至5月上旬逐旬的平均溫度與降水情況。圖1、圖2 分別為2020年1月1日至5月15日逐日平均溫度、最高溫度、最低溫度及逐日24小時(shí)變溫、降水變化圖。從表1 可見(jiàn)，2020年1月1日至5月上旬公安縣溫度偏高；尤其是1月下旬至3月中旬溫度異常偏高，即從1月19日至3月26日兩個(gè)多月時(shí)間（68 d）內(nèi)溫度較多年平均偏高3.5 ℃。但溫度的起伏波動(dòng)大，其中2月15日、3月27日、3月28日、4月11日、4月18日、5月5日24 小時(shí)變溫分別達(dá)到-11.3、-12.4、-10.2、-8.8、-7.8、-8.8 ℃；其降溫幅度前3 次超過(guò)了10 ℃以上，達(dá)到了寒潮級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，后3 次達(dá)到了強(qiáng)冷空氣標(biāo)準(zhǔn)。在降溫的同時(shí)伴隨降水，2月14—15日降水16.3 mm；3月27—29日降水58.4 mm；4月10—11日降水19.8 mm；4月18—20日降水109.1 mm；5月5—8日降水47.4 mm；其降水強(qiáng)度均達(dá)到了中到大雨以上，其中4月20日24 小時(shí)降水77.6 mm，為暴雨。水溫的波動(dòng)與大氣溫度密切相關(guān)，且在強(qiáng)降水助力下魚(yú)塘水體上下對(duì)流加強(qiáng)，一方面水溫快速下降，另一方面水質(zhì)下降。2020年1月下旬后溫度回升快，黃顙魚(yú)越冬時(shí)間短，之后溫度波動(dòng)大，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致其免疫功能降低，每次溫度大幅度下降后就會(huì)出現(xiàn)發(fā)病高峰，3月底4月初、4月中下旬及5月初均是大規(guī)模發(fā)病期。

表1 2020年1—5月公安縣逐旬溫度、降水

圖1 2020年1月1日—5月15日公安縣溫度逐日變化

圖2 2020年1月1日—5月15日 公安 縣24 小 時(shí)變 溫及降水逐日變化

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)潛江、公安等地黃顙魚(yú)發(fā)病池塘取病魚(yú)進(jìn)行病原菌分離、純化培養(yǎng)、16S rRNA 鑒定，分離鑒定出14 株維氏氣單胞菌和9 株類志賀鄰單胞菌。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)制定的《抗微生物敏感實(shí)驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（CLSI），對(duì)MIC 測(cè)定結(jié)果分為敏感（S）、中敏（I）、耐藥（R）3 種。從圖3 可以看出，在14株維氏氣單胞菌中，50%及以上的菌株對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考和磺胺間甲氧嘧啶出現(xiàn)耐藥性，10%～22%的菌株對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素和磺胺甲噁唑+甲氧芐啶出現(xiàn)耐藥性，所有菌株對(duì)硫酸新霉素和氟甲喹未產(chǎn)生耐藥性，對(duì)硫酸新霉素和氟甲喹的敏感菌株高達(dá)80%左右，表明使用硫酸新霉素和氟甲喹能很好地抑制采樣地區(qū)維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)。

圖3 14 株維氏氣單胞菌對(duì)抗菌藥物耐藥性測(cè)定結(jié)果

從圖4 可以看出，磺胺間甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑+甲氧芐啶對(duì)類志賀鄰單胞菌完全失效，9 株類志賀鄰單胞菌都對(duì)這兩種藥物產(chǎn)生耐藥性。而恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素也都對(duì)類志賀鄰單胞菌的效果不理想，超過(guò)60%的菌株對(duì)這幾種藥物產(chǎn)生耐藥性。44.44%的菌株對(duì)硫酸新霉素也產(chǎn)生了耐藥性。僅有氟甲喹對(duì)采樣地區(qū)的類志賀鄰單胞菌有較好的抑制作用，但對(duì)氟甲喹敏感的菌株所占比例較低，中敏菌株接近90%。

圖4 9 株類志賀鄰單胞菌對(duì)抗菌藥物耐藥性測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 發(fā)病原因

黃顙魚(yú)疾病主要由細(xì)菌性病原引起。根據(jù)采樣后細(xì)菌純化鑒定，判定主要致病菌為維氏氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌。

1）2020年1月底開(kāi)始至3月下旬，部分地區(qū)基本處于新冠肺炎疫情封控管理狀態(tài)，不能正常進(jìn)行飼料投喂、水位水質(zhì)調(diào)節(jié)等池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)管理，商品魚(yú)銷售受阻而造成存塘量過(guò)大，這是造成黃顙魚(yú)病害的重要原因之一。

2）追求高產(chǎn)，養(yǎng)殖密度大。發(fā)病池塘普遍為高密度黃顙魚(yú)單養(yǎng)模式，每公頃產(chǎn)量超過(guò)22 500 kg，密度過(guò)大，品種單一。黃顙魚(yú)屬于底層生活魚(yú)類，高密度養(yǎng)殖情況下，大量的黃顙魚(yú)聚集在底層，底層的水環(huán)境很容易惡化。

3）水質(zhì)惡化，黃顙魚(yú)抗病力下降。由于養(yǎng)殖密度大、投餌量大，且餌料粗蛋白含量高（粗蛋白質(zhì)含量約40%），大量的殘餌和排泄物排放到水中，這些物質(zhì)的分解需要消耗大量的溶解氧，產(chǎn)生氨氮、亞硝酸鹽氮等有毒物質(zhì)，對(duì)黃顙魚(yú)具有脅迫作用，降低抗病力。研究表明，養(yǎng)殖中投喂飼料的10%～20%未被攝食直接溶失到水中，攝入飼料中20%～25%的氮和25%～40%的磷（即投入飼料中約18%氮和25%磷）用于生長(zhǎng)，75%～80%的氮和60%～75%的磷以糞便和代謝物形式排入水環(huán)境［6，7］。高氨氮與高pH 環(huán)境對(duì)幼魚(yú)的生長(zhǎng)、飼料利用與肝臟SOD 活力有明顯的抑制作用［8］。李波等［9］試驗(yàn)表明，在DO 為6.5～7.2 mg/L，水溫27.6～27.2 ℃條件下，試驗(yàn)為期56 d，非離子氨濃度0.44、0.88 mg/L 時(shí)黃顙魚(yú)出現(xiàn)了明顯的充血、出血、腐皮和爛尾等癥狀，中毒魚(yú)體表黏液明顯增多，身體瘦弱，游泳緩慢，身體各鰭條出現(xiàn)缺損，胸鰭基部充血，有些死亡個(gè)體尾部潰爛，鰓部充血；解剖魚(yú)體內(nèi)臟，肝臟發(fā)白，腸道內(nèi)食物較少，特別在試驗(yàn)的后期，出現(xiàn)大量死亡，說(shuō)明非離子氨對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)具有慢性脅迫作用。據(jù)調(diào)查的部分池塘，水體pH偏高，最高的9.5 以上，當(dāng)時(shí)水溫20～29 ℃。水溫20 ℃、pH 9.5 時(shí)，非離子氨占總氨氮的56%；水溫25 ℃、pH 9.5 時(shí)，非離子氨占總氨氮的64%?？梢?jiàn)，發(fā)病池塘非離子氨的濃度較高，對(duì)黃顙魚(yú)構(gòu)成脅迫效應(yīng)。

4）過(guò)度投喂，引發(fā)消化障礙。疫情解封以后，養(yǎng)殖戶為了彌補(bǔ)疫情期間的損失，同時(shí)在黃顙魚(yú)市場(chǎng)價(jià)格看好的刺激下，加大飼料投喂量。黃顙魚(yú)生性貪食，過(guò)量攝食。當(dāng)遇到水質(zhì)惡化、缺氧、水溫下降等不利環(huán)境時(shí)，消化功能受影響，抗應(yīng)激能力差，容易感染發(fā)病。

5）水溫的劇烈變化，特別是劇烈降溫導(dǎo)致魚(yú)病發(fā)生。據(jù)溫度記錄分析發(fā)現(xiàn)，每次溫度大幅度下降后就會(huì)出現(xiàn)發(fā)病高峰，3月底4月初、4月中下旬及5月初均是大規(guī)模發(fā)病期。一方面水體溫度的變化會(huì)擾亂魚(yú)類內(nèi)分泌系統(tǒng)、削弱機(jī)體免疫能力等，主要影響魚(yú)類抗體分泌、免疫活性細(xì)胞的活性及數(shù)量、溶菌酶活性及補(bǔ)體活化途徑及活性［10］。另一方面，魚(yú)類是變溫動(dòng)物，其代謝過(guò)程受外界環(huán)境溫度的影響較大，消化酶的活性和消化功能受水溫的影響，黃顙魚(yú)胃腸道蛋白酶活性在20～40 ℃范圍內(nèi)隨溫度升高活性逐漸增強(qiáng)，40 ℃以后，酶活性又逐漸降低［11］。魚(yú)類淀粉酶、蛋白酶作為消化道內(nèi)高效專一的生物催化劑，受溫度影響較大，在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度上升催化反應(yīng)的速度增加，超過(guò)一定溫度催化活性反而降低。黃顙魚(yú)淀粉酶和蛋白酶的最適溫度分別為25 ℃和50 ℃［12］。如果投喂過(guò)量，黃顙魚(yú)大量攝食，水溫急劇下降，各種消化酶的活性也會(huì)隨之下降，造成胃內(nèi)食物不能及時(shí)消化。另外，水溫劇烈變化對(duì)水體生物化學(xué)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生影響，如硝化作用和反硝化作用細(xì)菌活性可能因水溫驟降而降低。

3.2 細(xì)菌耐藥性

維氏氣單胞菌屬于氣單胞菌屬中危害較大的運(yùn)動(dòng)性嗜溫性氣單胞菌類，最適生長(zhǎng)溫度為28～37 ℃［13］。維氏氣單胞菌能感染多種水生生物，如加州鱸［14］、羅非魚(yú)［15］、草魚(yú)［16］、紅鮰［17］、克氏原螯蝦［18］、大刺鰍［19］等。已有研究表明，維氏氣單胞菌感染能引起黃顙魚(yú)腹部膨大、體內(nèi)積液、鰭條充血、肛門紅腫、體表潰爛等癥狀［1］，與本研究所發(fā)現(xiàn)的病魚(yú)表征類似。

類志賀鄰單胞菌為弧菌科鄰單胞菌屬，在水環(huán)境中分布廣泛。曹恒源［20］認(rèn)為類志賀鄰單胞菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，養(yǎng)殖魚(yú)類中攜帶較多，作為致病菌所引起的魚(yú)類患病疫情一般集中發(fā)生在每年4—8月間，發(fā)病水溫一般在17～28 ℃。類志賀鄰單胞菌致病的最顯著特點(diǎn)就是腸道疾病，本次發(fā)病的部分病魚(yú)也有胃部充滿黏性積液、腸后段紅色、果凍樣，與類志賀鄰單胞菌感染所產(chǎn)生的癥狀相似。

藥敏試驗(yàn)使用了8 種國(guó)標(biāo)漁藥，80%左右的維氏氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹敏感，半數(shù)的維氏氣單胞菌對(duì)甲砜霉素和氟苯尼考敏感，而磺胺間甲氧嘧啶對(duì)維氏氣單胞菌幾乎無(wú)效。與徐洋等［2］和周勇等［3］關(guān)于恩諾沙星和氟苯尼考的敏感性結(jié)果一致。本次分離的類志賀鄰單胞菌僅對(duì)氟甲喹中敏，其他7 種國(guó)標(biāo)漁藥對(duì)其幾乎無(wú)效。與龍?zhí)K等［5］關(guān)于恩諾沙星、氟苯尼考和磺胺間甲氧嘧啶的耐藥性結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。分析原因可能與類志賀鄰單胞菌的特性相關(guān)，類志賀鄰單胞菌廣泛存在于水體中，作為條件致病菌，只有當(dāng)溫度等環(huán)境條件適宜時(shí)才會(huì)導(dǎo)致水生生物致病。而近年來(lái)，不規(guī)范使用添加有抗生素的生物制劑、中草藥等，導(dǎo)致水體中的類志賀鄰單胞菌獲得較為多的抗藥性［21，22］。

3.3 防控措施

堅(jiān)持預(yù)防為主，防重于治的原則，加強(qiáng)養(yǎng)殖生產(chǎn)管理，做好綜合防治。

預(yù)防措施：養(yǎng)殖池塘要有良好的水源水質(zhì)，獨(dú)立的進(jìn)排水系統(tǒng)，淤泥厚度不超過(guò)15 cm；做好清塘消毒，改善池塘底質(zhì)環(huán)境，魚(yú)種放養(yǎng)前進(jìn)行消毒；對(duì)工具實(shí)行徹底消毒和曝曬，防止染病池塘水體隨意排放至公共溝渠，杜絕病原擴(kuò)散。及時(shí)撈出病死魚(yú)，用生石灰消毒后深埋，避免進(jìn)一步傳染；優(yōu)化養(yǎng)殖模式，大力倡導(dǎo)健康養(yǎng)殖模式，控制放養(yǎng)密度，不宜追求過(guò)高的產(chǎn)量；科學(xué)合理投喂，投喂優(yōu)質(zhì)飼料，切忌過(guò)度投喂，特別是春季水溫不穩(wěn)定時(shí)期需要控制投喂量，日投餌率宜低于1%；定期添加多種維生素、多糖以及天然植物抗菌藥物，增強(qiáng)魚(yú)體抵抗力；加強(qiáng)水質(zhì)管理，定期施用微生態(tài)制劑調(diào)控水質(zhì)，保持水體底層有充足的溶解氧，春季池塘水深宜控制在1.2 m 以內(nèi)。密切注意天氣變化，遇天氣劇烈變化時(shí)應(yīng)及時(shí)減少投餌量，保持水環(huán)境穩(wěn)定，停止拉網(wǎng)。實(shí)施水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫制度，從源頭控制病害傳播。

治療措施：疾病發(fā)生時(shí)全池潑灑聚維酮碘、二氧化氯或者生石灰等消毒劑，殺滅病原體；潑灑生石灰前，測(cè)量并確認(rèn)池塘水體pH 不超過(guò)8.5；準(zhǔn)確診斷，細(xì)菌性疾病內(nèi)服國(guó)標(biāo)抗菌藥物，用藥前對(duì)病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感藥物進(jìn)行治療；不使用敵百蟲(chóng)、硫酸銅等刺激性強(qiáng)的藥物，多種藥物不同時(shí)混合使用；內(nèi)服天然植物抗菌/抗病毒藥物，如魚(yú)腥草、大黃、黃芪、大青葉、板藍(lán)根等的合劑。煮水拌飼料投喂或超微粉拌飼料投喂均可。劑量為每千克魚(yú)體0.5～0.8 g，連續(xù)投喂5～6 d。