潘陽陽，周德貴，黃道強，王重榮，李 宏，王志東，陳宜波，趙 雷，龔 蓉，周少川

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室/廣東省水稻工程實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】廣東是我國重要的水稻主產(chǎn)省份之一，國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，近5 年廣東稻谷年播種面積在180 萬hm2左右，產(chǎn)量達1 050 萬t。當(dāng)前，水稻產(chǎn)業(yè)處于提質(zhì)增效轉(zhuǎn)型關(guān)鍵期，發(fā)展優(yōu)質(zhì)稻是提高種植效益、優(yōu)化品種結(jié)構(gòu)的重要舉措［1］。廣東優(yōu)質(zhì)稻育種在全國處于領(lǐng)先地位［2］，于2018 年提出振興廣東絲苗米戰(zhàn)略，以絲苗米產(chǎn)業(yè)園為抓手，打造絲苗米品牌。首屆全國優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)鑒評中，廣東絲苗米品種美香占2 號、象牙香占和增科新選絲苗1 號獲得首屆全國十大優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)鑒評（秈稻）金獎，此后美香占2 號又連續(xù)獲得第二屆和第三屆全國優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)鑒評金獎，已成為絲苗米產(chǎn)業(yè)園主栽品種。截至2021 年1 月，廣東已創(chuàng)建18 個省級絲苗米產(chǎn)業(yè)園，有力帶動了優(yōu)質(zhì)米產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。香味是絲苗米必須具備的食味品質(zhì)性狀，是稻米價格的重要決定因素［3］。因此，解析絲苗米品種香味物質(zhì)組分，特別是從動態(tài)角度考量水稻發(fā)育過程中香味物質(zhì)的變化，對于打造不同類型香米品牌、培育廣東絲苗米新品種具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M展】香味是稻米的重要品質(zhì)性狀，泰國香米、五常大米等品牌稻米均具有濃郁的香味，除日本以外多數(shù)亞洲國家消費者對香味具有偏好性。稻米中已發(fā)現(xiàn)上百種揮發(fā)性化合物［4-7］，通常根據(jù)香米散發(fā)出來的香氣差異，將香型分為爆米花型、茉莉花型、紫羅蘭型、山核桃型等［8］。1983 年，Buttery 等［9］確認2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）是香稻特征香氣成分，2AP 是一種極易揮發(fā)的親脂性小分子化合物，其閾值僅為0.1 μg/kg，呈典型“爆米花”香味而極易被感知，幾乎在所有香稻中均能被檢出［10］。研究表明，香稻是由于香味基因BADH2功能性缺失，導(dǎo)致2AP 被特異積累［11-12］。香稻地上組織中2AP 含量通常高于精米［13］，籽粒中90%以上2AP 分布于精米，米糠中2AP 含量不足10%［14］。不同的badh2突變類型導(dǎo)致2AP 積累程度表現(xiàn)出較大差異［15］，即使是相同的badh2突變類型，其2AP 含量也存在明顯差異［16-17］，一方面由于品種間存在適應(yīng)性的差異，另一方面與2AP 代謝通路中其他基因活性密切相關(guān)［18］；此外，產(chǎn)地、氣候、栽培方法、儲藏條件等環(huán)境因素均能夠影響香味強度［19-23］，即使同一品種在不同地域種植，其香味往往表現(xiàn)不同。除2AP外，其他類型香味化合物也是導(dǎo)致香稻間食味品質(zhì)差異的重要因素。Widjaja 等［24］對3 種香米米飯的揮發(fā)性物質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)，Jasmine 和Goolarah 的吲哚含量更高，而Basmati 的2-苯基乙醇含量最高、正己醛含量最低。Yang 等［25］對6 種不同風(fēng)味米飯的揮發(fā)性成分進行分析，其中2-AP、己醛、2-壬烯醛，辛醛、庚醛和壬醛的氣味活性值占比均達97%以上，而1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、2,4-壬二烯醛、2,4-癸二烯醛、癸醛、2-庚酮和愈創(chuàng)木酚對不同類型稻米風(fēng)味的形成起重要貢獻；Hinge 等［26］比較Basmati-370 和Ambemohar-157在籽粒成熟過程中的香味物質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)Basmati-370 中2AP 含量低于Ambemohar-157，但2-壬醛、壬醛、庚醛、辛醇、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃的含量均顯著高于后者，這可能是兩者風(fēng)味差異的主要原因?！颈狙芯壳腥朦c】關(guān)于廣東優(yōu)質(zhì)絲苗米香味成分的比較研究較少，特別是對不同組織器官、尤其是對生殖生長階段的枝梗、穎殼等組織中的香味物質(zhì)鮮有研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對美香占2 號和象牙香占兩個廣東絲苗米代表品種生長發(fā)育過程中的香味物質(zhì)進行分析，揭示香味物質(zhì)變化特性，比較兩個品種香味物質(zhì)差異，重點揭示2AP 在籽粒發(fā)育過程中的含量變化特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試品種與種植條件 選用廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所保存的美香占2 號和象牙香占水稻品種種子，于2019 晚季在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所大豐育種基地種植，單株移栽，株行距為16.7 cm×16.7 cm，兩行后隔一行種植，采用常規(guī)水肥方式管理。

1.1.2樣品采集 分別收集拔節(jié)期頂二葉（S1）、孕穗期穗（S2 為穎花、S3 為枝梗）、開花后10 d谷粒（S4 為乳熟期籽粒，S5 為穎殼）、20 d 谷粒（S6為蠟熟期籽粒，S7 為穎殼）、30 d 谷粒（S8 為成熟期籽粒，S9 為穎殼）。每個樣品由12 個以上單株樣品混合制備，所有樣品均在上午9：00—10：00 收集，液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱；收集兩個品種自然曬干的谷粒，后續(xù)處理獲得S10糙米和S11 精米。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品制備 對冷凍鮮樣進行真空冷凍干燥處理：采用德國Christ 凍干機（型號Alpha 1-4 LSC basic），在-40 ℃真空冷凍條件下對S1～S9等樣品干燥48 h。葉片、枝梗和谷殼等樣品采用IKA 研磨器研磨4～5 min 至無法繼續(xù)粉碎為止。

稻谷利用礱谷機（中儲糧有限公司，型號JIG-Ⅲ）進行 脫殼，獲得相應(yīng)糙米，再經(jīng)碾米機（中儲糧有限公司，型號JNM-III）對糙米進行去皮，獲得精米。利用芬蘭Perten3310 型實驗室粉碎磨機對籽粒樣品、糙米和精米進行研磨，粉末樣品過425 μm 孔徑篩網(wǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.2.2揮發(fā)性成分萃取 采用瑞士CTC Analytics AG 公司多功能自動進樣系統(tǒng)RTC120，準確稱取2 g 粉狀樣品，放入20 mL 頂空瓶中，加入1 μL 2,4,6-三甲基吡啶（TMP，溶于乙醚，濃度0.05 mg/mL）作為內(nèi)標，迅速擰緊頂空瓶瓶蓋，放入90 ℃水浴鍋中，平衡5 min 后，迅速插入固相微萃取裝置（SPME Arrow DVB/CWR/PDMS 萃取頭），90 ℃條件下吸附40 min。

1.2.3揮發(fā)性成分檢測 把萃取頭插入色譜儀的進樣口進行解吸附，進樣口溫度為250 ℃，解吸附時間為2 min。利用安捷倫8890 氣相色譜串聯(lián)5977B 質(zhì)譜儀對樣品的揮發(fā)性成分進行數(shù)據(jù)采集和分析。

氣相條件：氣相色譜柱DB-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm，美國安捷倫公司）；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；不分流進樣，程序化升溫為35 ℃保持3 min，隨后以5 ℃/min 的速率上升至85 ℃，保持5 min 后以相同速率上升至120 ℃，保持6 min 后以相同速率上升至210 ℃，傳輸線溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊型離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；掃描模式為全掃，m/z 為35～450。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 對GC-MS 檢測所得的原始數(shù)據(jù)利用Masshunter 工作站進行處理，并與NIST17庫中數(shù)據(jù)比對，以質(zhì)譜數(shù)據(jù)（匹配度得分大于70.0）和線性保留指數(shù)（偏差在10 個單位內(nèi)），確定揮發(fā)性物質(zhì)成分。以TMP 為內(nèi)標，計算各化合物的相對含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻樣品中香味物質(zhì)成分分析

美香占2 號和象牙香占各11 份不同時期的樣品揮發(fā)物成分及含量見表1。所有水稻樣品共檢出63 種香味物質(zhì)，分為雜環(huán)類、烴類、醛類、醇類、酮類、酯類和其他等7 類，每類分別含有5、11、16、9、12、8、2 種香味物質(zhì)。大多數(shù)樣品香味物質(zhì)數(shù)量在35～40 種之間，每個樣品平均含36 種化合物，其中十二烷、十三烷、十四烷、己醛、庚醛、苯甲醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、苯甲醇、正壬醇、香葉基丙酮和辛酸乙酯等14 種物質(zhì)在所有樣品中均被檢出。此外，2AP、十一烷、5-甲基十三烷、3-甲基十三烷、2,6,10-三甲基十二烷、1,2,3,4-四氫-1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）萘、2-壬烯醛和正己醇等8 種物質(zhì)在所有籽粒樣品中均被檢出。

相同時期兩個品種間香味物質(zhì)種類相近，均在孕穗期最多，其中美香占2 號孕穗期穎花和枝梗分別含有40、43 種香味物質(zhì)，象牙香占孕穗期穎花中含有42 種香味物質(zhì)；穎殼中香味物質(zhì)種類較少，其中10 d 穎殼中香味物質(zhì)種類最少，分別為28、27 種。所有香味物質(zhì)中，僅三甲基環(huán)己烯酮在美香占2 號中被特異檢出，2-辛烯-1-醇只在象牙香占中被檢出。以上結(jié)果表明美香占2 號和象牙香占香味物質(zhì)構(gòu)成相似，且在籽粒成熟過程中，香味物質(zhì)種類變化特征基本一致。

2.2 不同水稻樣品間香味物質(zhì)含量比較

對63 種香味物質(zhì)含量進行分析發(fā)現(xiàn)，美香占2 號孕穗期枝梗中有19 個化合物含量達到最高，此外孕穗期穎花、10 d 穎殼和葉片分別含有13、11、8 個峰值化合物，孕穗期穎花和枝梗中峰值香味物質(zhì)數(shù)量占比達一半以上，包括大多數(shù)醛類、醇類和酮類，表明美香占2 號在孕穗期香味物質(zhì)種類最多，且多數(shù)物質(zhì)在此時含量最高。象牙香占在孕穗期穎花和10 d 穎殼中各含有16 個峰值化合物，包括大多數(shù)醛類、烴類、酮類和醇類，而葉片和孕穗期枝梗中分別有10、3 個含量最高化合物，表明象牙香占在孕穗期和開花初期香味物質(zhì)含量最為豐富。值得注意的是，個別香味物質(zhì)在30 d 穎殼中含量最高，如具有柑橘香味的正壬醇，以及象牙香占中具有菠蘿香味的辛酸乙酯和2-辛烯酸乙酯，說明水稻發(fā)育過程中不同香味物質(zhì)的合成代謝和積累特性存在明顯差異。

2.3 兩個香稻品種發(fā)育過程中2AP 含量比較

從圖1 可以看出，美香占2 號和象牙香占2AP 均在葉片中含量最高，分別達104.93、119.25 ng/g，籽粒中2AP 含量明顯低于葉片，隨著籽粒成熟2AP 含量呈下降趨勢，糙米中2AP 含量分別為3.86、8.06 ng/g，所有穎殼樣品中未檢出2AP。美香占2 號孕穗期穎花和枝梗中2AP 總量高于葉片，但各時期籽粒中2AP 含量均低于象牙香占。從籽粒2AP 空間分布來看，美香占2 號精米與糙米2AP 含量比為97.9%，象牙香占精米2AP 占64.4%，說明美香占2 號籽粒2AP 主要積累在胚乳中。

圖1 兩個香稻品種不同發(fā)育時期2AP 含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of 2AP content in two aromatic rice cultivars at various developmental stages

2.4 糙米和精米中香味物質(zhì)的比較

兩個香稻品種糙米和精米中香味物質(zhì)含量豐富，包含所有烴類、大多數(shù)醛類和醇類、少數(shù)酮類和酯類共約40 種香味化合物。從表2 可以看出，烴類含量最高，其次為醛類和醇類，糙米中各類香味物質(zhì)含量整體高于精米，個別物質(zhì)如1-辛烯-3-醇、4-氧代異佛爾酮在精米中未檢出，表明糙米中香味物質(zhì)組分和含量多于精米。此外，2-甲基苯并呋喃、正庚醇和γ-壬內(nèi)酯只在糙米或精米中被檢出，說明在大米加工過程中能夠產(chǎn)生個別新的香味物質(zhì)。

表2 兩個香稻品種糙米和精米中揮發(fā)性成分含量Table 2 Contents of volatile components in brown rice and polished rice of two aromatic rice cultivars（ng/g）

進一步比較兩個香稻品種精米中香味物質(zhì)差異發(fā)現(xiàn)，美香占2 號精米除2AP 含量低于象牙香占外，其他烴類、醛類、醇類、酮類和酯類中的多數(shù)組分含量均略高于象牙香占。另外，1,2,4-三甲基苯、異佛爾酮只在美香占2 號精米中被檢出，而苯乙醛、1-辛烯-3-醇和γ-壬內(nèi)酯在象牙香占精米中被特異檢出，這些香味物質(zhì)構(gòu)成及含量的差異，可能對兩種米飯飯香的塑造起重要作用。

3 討論

頂空固相微萃取法是目前香味物質(zhì)檢測的主要方法［17,27-29］，本試驗采用瑞士CTC 公司RTC120 自動化取樣設(shè)備，結(jié)合目前最高性能的安捷倫8890 氣相色譜串聯(lián)5977B 系統(tǒng)，在前期對香稻糙米2AP 含量測定所需的萃取溫度、萃取時間和上樣量等條件進行優(yōu)化基礎(chǔ)上，一次性對所有樣品進行測定，數(shù)據(jù)偏差小，可信度較高。

從香味物質(zhì)的分布來看，葉片中不含特定的香味成分，只有8～10 種香味物質(zhì)在葉片中含量達到峰值，而孕穗期香味物質(zhì)積累最為豐富，表明香味物質(zhì)在生殖生長時期能夠被持續(xù)合成，由于香味物質(zhì)具有極易揮發(fā)的特性［30］，這可能是水稻開花期“稻香”最濃郁的原因所在。同時，通過改善孕穗期水肥管理，有助于2AP 積累［31-32］。另外，發(fā)現(xiàn)11～16 個香味物質(zhì)在10 d 或30 d 穎殼中含量最高，其生物學(xué)意義尚不清楚。

在食味品質(zhì)鑒評中，象牙香占較美香占2 號具有更濃的香味［33］；同時，Luo 等［34］、Okpala 等［35］均發(fā)現(xiàn)象牙香占籽粒中2AP 含量高于美香占2 號，本研究與其結(jié)果一致。同時，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，美香占2 號在各時期籽粒中2AP 含量均低于象牙香占，這可能與2AP 代謝通路的調(diào)控密切相關(guān)，具體原因有待進一步研究。

美香占2 號和象牙香占是當(dāng)前廣東絲苗米的代表品種，成熟籽粒中檢出40 多種香味物質(zhì)，與Basmati-370 籽粒中54 種香味物質(zhì)［26］、泰國香米91 種香氣成分和五常大米68 種香氣成分［36］相比，所有香稻中2AP 均是香稻香味構(gòu)成的主要成分，同時，烴類、醛類和醇類化合物含量最為豐富，但不同類型香米中香味化合物種類有較大差異，如Basmati-370 中含有香草醛、芳樟醇、2-乙基-1-己醇、水楊酸甲酯等香味物質(zhì)，泰國香米中的正己醇、1-辛烯-3-醇、苯酚、4-甲基苯酚、正己醇和1-辛烯-3-醇等，五常大米中香草醛、2,4-葵二烯醛、3-甲基苯酚、4-甲基苯酚和苯丙酮等化合物，而絲苗米中含有反式肉桂醛、苯甲醇、正壬醇、辛酸乙酯等物質(zhì)，這些化合物可能對各自香米特征性風(fēng)味的形成發(fā)揮作用。

由于米糠中營養(yǎng)素和生理活性物質(zhì)含量遠高于胚乳［37-38］，糙米的營養(yǎng)價值要高于精米，本研究也發(fā)現(xiàn)糙米中香味物質(zhì)含量明顯多于精米。因此，在絲苗米品牌創(chuàng)建過程中要注重加工環(huán)節(jié)，應(yīng)當(dāng)防止絲苗米過度精加工，同時有必要建立相關(guān)的糙米食味評價指標及體系，對于強化稻米營養(yǎng)價值、提高米飯飯香具有重要意義。

4 結(jié)論

本試驗分析了美香占2 號和象牙香占兩個優(yōu)質(zhì)香稻不同發(fā)育時期11 份樣品的香味物質(zhì)成分，共檢測到63 種香味物質(zhì)，每個樣品平均含36 種化合物，美香占2 號在孕穗期枝梗中含有43 種化合物，其中19 個物質(zhì)在此時期含量最高，象牙香占孕穗期穎花中含有的化合物種類最多為42 種，其中16 個為峰值化合物，這些物質(zhì)包括多數(shù)醛類、醇類和酮類化合物；兩個品種在10 d 穎殼中香味物質(zhì)種類最少，分別有28 種和27 種化合物，表明兩個香稻品種在生長發(fā)育過程中香味物質(zhì)變化特性整體相似，孕穗期是香味物質(zhì)積累的關(guān)鍵時期。葉片中2AP 含量最高，隨著籽粒成熟，各樣品中2AP 含量呈下降趨勢，而象牙香占各時期籽粒2AP 含量均高于美香占2 號，但精米中烴類、醛類、醇類、酮類和酯類等多數(shù)香味化合物含量低于美香占2 號，這可能是兩者飯香差異的主要原因。本研究揭示了香稻中香味物質(zhì)的動態(tài)變化特性，將為研究香稻品種特性、推進優(yōu)質(zhì)香米品牌建設(shè)等提供理論依據(jù)。