梁玉婷，夏文勝，王 樸，段慶明

（武漢市園林科學研究院，武漢 430081）

扦插是快速繁殖植物的方式之一，扦插通常利用植物莖、葉或芽通過適合的條件培育長成完整植株。扦插生根是首要解決的問題。插穗生根是植物再生的過程，通過化學物質(zhì)激活根原基，促進生根［1］，其中植物不定根的發(fā)生和生長與過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸酶（IAAO）有緊密的聯(lián)系［2］，高等植物體內(nèi)普遍含有的IAAO、POD、PPO 等酶類，在生根過程中呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化，它們的活性在植物不定根生長和發(fā)育中起重要作用。吲哚乙酸（IAA）是植物體內(nèi)最常見的主要內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑，其含量隨著吲哚乙酸酶和過氧化物酶發(fā)生一系列的動態(tài)變化，通過分解代謝維持植物體內(nèi)的生長素含量，維持植物的正常生長發(fā)育，POD具有利用酚類和吲哚類化合物作為供氫體催化IAA氧化脫羧［3］，高濃度的酚類物質(zhì)在PPO 的作用下促進愈傷組織分化，進而合成促進生根的物質(zhì)［4］，PPO被認為是“生根素”的組成部分，影響細胞分裂、分化及根原基的產(chǎn)生和生長［5，6］。有研究認為，不定根表達時IAAO 活性較高，可降低體內(nèi)IAA 含量以促進根的伸長［7］。有學者認為IAA 氧化產(chǎn)物可以促進根原基形成，酚類復合體可以促進根原基形成［8］，也有學者認為在不定根表達期，較高濃度的IAA 促進不定根生長［9，10］。已知IAA 一個非常重要的生理功能是促進不定根的形成，而POD 能氧化IAA［11］，難生根植物葉的POD 活性高，降解IAA 的作用強，葉中IAA 被破壞較多，向下輸送的IAA 含量就會減少，這對誘導生根不利［12］。

莖是扦插生根的基礎材料，莖的解剖結構與扦插生根難易有關［13］。張煥欣等［14］認為不定根的產(chǎn)生由外部環(huán)境信號和內(nèi)部遺傳因子共同作用，是一個復雜的器官發(fā)生過程，扦插生根過程可以分為4個階段：愈傷組織形成的階段、不定根的誘導階段、不定根的發(fā)生階段、不定根的伸長階段［15］。扦插后可由愈傷組織、皮部誘導產(chǎn)生不定根，出現(xiàn)皮部生根、愈傷組織生根、愈傷組織兼具皮部生根3 種類型；有的插穗中存在少量潛伏根原基，插穗生根類型以誘導生根為主；不定根原基誘導產(chǎn)生于愈傷組織、木質(zhì)部、形成層及次生韌皮部等部位［16］。一般存在潛伏根原基的樹種扦插較易生根［17］，皮部生根型植物為扦插后根直接從皮部伸出，不產(chǎn)生愈傷組織，或產(chǎn)生的愈傷組織與扦插生根無關，皮部生根通常在插穗切口附近或切口上方皮部產(chǎn)生。與愈傷組織生根相比，皮部生根型的根原基直接與莖維管組織相連，更有利于對水分養(yǎng)分的輸送，有利于插穗后續(xù)成活，硬枝中皮層較薄，周皮中栓質(zhì)化的木栓層層數(shù)較多，導致硬枝扦插生根較困難［18］，外源信號刺激可誘導不定根原基的發(fā)生，甚至改變不定根發(fā)生類型，從而提高生根率并縮短生根周期［19-21］。

不定根的形成是木本植物扦插繁殖關鍵步驟，本試驗材料紅花玉蘭（Magnolia wufengensisL.Y.Ma et L.R.Wang）是一種少有的高大觀花落葉喬木［22］，能適應華中至華北大部分區(qū)域的氣候，可栽植于山體、街道、公園，是具推廣價值的園林綠化樹種，其繁殖方式僅靠嫁接及播種，至今扦插技術仍未取得突破進展，扦插生根率僅為36%～56%［23，24］，而國內(nèi)外對紅花玉蘭扦插生根機理研究較少，對于PPO 和IAAO 與紅花玉蘭不定根形成關系的研究就更少。本試驗通過測定紅花玉蘭插穗在生根過程中IAAO、PPO、POD 活性，以及在扦插生根過程中的細胞解剖結構進程，以揭示難生根樹種的IAAO、POD、PPO 與生根能力大小的內(nèi)在聯(lián)系，以驗證紅花玉蘭扦插生根IAAO、PPO、POD 有動態(tài)響應，紅花玉蘭插穗生根方式為誘導式。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料紅花玉蘭采于湖北省武漢市園林科學研究院中試基地，生根誘導劑使用750 mg/L NAA 蘸1 min，清水處理組（CK）蘸清水1 min。

1.2 材料采集與處理

于2017年4月2日剪取無病蟲害、直徑約0.6 cm已經(jīng)木質(zhì)化的嫩枝作插穗，插穗保留2～3 個芽，長度約為10～12 cm，上切口平剪，距頂上端芽1 cm 左右，下切口在芽下方斜切，距芽0.5 cm 左右。準備50 穴穴盤6 組，其中3 組為試驗組，另外3 組為對照組，分別進行扦插生根統(tǒng)計、酶活性處理、解剖結構用。穴盤中裝入體積比為1∶1 的園土和沙作為扦插基質(zhì)在扦插前滅菌，澆透水后，用筷子扎好小洞，備用；將剪好的插穗下端迅速在配置好的750 mg/L NAA 中浸泡處理1 min，對照組的插穗在清水中浸泡1 min。隨后插入事先戳好的洞中，扦插深度為2～3 cm，然后撫平；每隔7 d 噴施1 次稀釋1 000 倍的多菌靈溶液，另外每隔3 d 噴施100 mg/L 磷酸二氫鉀溶液。

1.3 試驗設計

自扦插日起，每隔7 d 取樣一次，選取插穗基部2 cm 范圍內(nèi)的皮層剪碎混合均勻用于進行POD 和IAAO、PPO 活性測定。POD 采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，PPO 采用鄰苯二酚比色法測定［25］、IAAO 采用二氯酚比色法測定［26］。

每隔7 d 觀察插穗的形態(tài)變化及褐化情況，隨機選取5 支插穗，分別記錄愈傷組織出現(xiàn)期、不定根出現(xiàn)期，于70 d 進行生根率統(tǒng)計。選取不同時期插穗各6 支，在其基部0.5 mm 范圍進行石蠟切片，從細胞解剖學探究其不定根萌發(fā)機理［27］。

2 結果與分析

2.1 紅花玉蘭硬枝扦插生根外部表現(xiàn)以及生根率

紅花玉蘭插穗CK 組在處理7 d 后愈傷組織側芽開始萌動（圖1），同時部分插穗基部開始褐化，在后續(xù)時間褐化深度達2 cm 左右，萌發(fā)葉開展，21 d萌發(fā)葉干枯凋落，緊接著整個枝條褐化；清水處理組（CK）個別插穗在15 d 后出現(xiàn)愈傷組織，但直到35 d仍未出現(xiàn)不定根，且插穗幾乎全部干枯。處理組一部分插穗下端在7 d 時出現(xiàn)0.5 cm 寬的褐化，在后續(xù)的時間褐化上升同時上端芽膨大伸展，14 d 時葉展開，21 d 時葉干枯，絕大部分插穗在扦插后7 d 處理組出現(xiàn)皮孔增大，少部分基部出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，14～21 d基部出現(xiàn)白色愈傷組織，皮孔增大現(xiàn)象更普遍，28 d肉眼可見皮孔有小凸起，愈傷組織變毛糙，35 d 肉眼可見皮孔生根，愈傷組織生根，42 d 根繼續(xù)生長，生根率為36%。從圖2 可見，紅花玉蘭的生根方式為混合生根，即不定根產(chǎn)生方式有皮部生根和愈傷組織生根兩種。

圖1 紅花玉蘭扦插情況

圖2 紅花玉蘭插穗基部的愈傷組織（a）和生根情況（b、c）

2.2 紅花玉蘭處理組插穗解剖研究

2.2.1 紅花玉蘭扦插前插穗莖基部 試驗第1 天時，取樣后得到的紅花玉蘭莖段橫切顯示了正常的組織結構（圖3a、圖3b），木質(zhì)部有一個圓形的維管環(huán)和韌皮部，光學顯微鏡顯示表皮以及從內(nèi)至外的各層細胞，包括厚壁組織、初生木質(zhì)部、次生韌皮部和木質(zhì)部，以及一定數(shù)量的皮孔。

從插穗橫切面觀察到，由里向外依次為維管柱（維管束和髓）、皮層、表皮3 大部分（圖3a），通過對插穗3 段不連續(xù)和3 張連續(xù)橫切面切片進行觀察，在插穗木質(zhì)部、韌皮部、皮層、形成層等部位均未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基，表明在紅花玉蘭的自然生長過程中其枝條內(nèi)沒有根原基存在。

圖3 紅花玉蘭插穗莖基部橫切面

2.2.2 紅花玉蘭生根過程 扦插7 d 后，觀察到插穗基部切口處逐漸產(chǎn)生一圈白色或黃色的愈傷組織（圖2），愈傷組織最初是一團近圓形、排列疏松、形狀較大的薄壁細胞。14 d 莖段生根區(qū)域的橫切面（激發(fā)階段）顯示擬分生組織日益增多，逐漸變成特化、典型的根原基（圖4a），根從形成層中柱鞘向次生木質(zhì)部和韌皮部延展；增加根原基的細胞數(shù)量和體積，并產(chǎn)生突出物在莖的外部。根原基的分化是觀察它們向周皮的延伸垂直于主軸。扦插21 d 后，形成愈傷組織的薄壁細胞胞數(shù)量不斷增加，其中一些細胞分化形成新的木質(zhì)部和形成層，特化成具有根原始體特征的細胞在木質(zhì)部外側顯現(xiàn)出來。具有根原始體特征的細胞繼續(xù)分化成近圓形的細胞團，根原基團繼續(xù)伸長（圖4b）。

圖4 紅花玉蘭插穗莖基部橫切面

插穗扦插21 d 后，莖基部距切口5～10 mm 處皮孔開裂，有不定根產(chǎn)生（圖2），該不定根起源于木質(zhì)部和韌皮部之間維管形成層的具有強烈分裂能力的薄壁細胞，逐漸構成的分生組織團塊繼續(xù)進行平周和垂周分裂，形成不定根原基，根原基沿著韌皮射線伸展方向發(fā)展，形成不定根維管系統(tǒng)，并與插穗中的維管組織相連，內(nèi)部出現(xiàn)明顯的分層，逐漸形成具有根冠、分生區(qū)及伸長區(qū)結構的不定根，根穿越皮層，最終伸出周皮（圖5）；在28 d 時，根部橫切顯示，不定根沖出表皮細胞，向外延展（圖6），正常情況下，在木本植物枝條的形成層處有許多特殊的薄壁細胞群，稱為根原始體或根原基，這是產(chǎn)生大量不定根的細胞基礎。通過細胞分裂，分化成鈍圓錐形的根原始體，向外穿過韌皮部與皮孔相通，向內(nèi)連接木質(zhì)部與髓相通，為不定根的產(chǎn)生從髓吸取營養(yǎng)物質(zhì)。根原基與外植體的氣孔相通，部分根原基的頂端有一組細胞排成半圓形，形成根冠。根原基穿透表皮和周皮突出于外植體組織外，逐漸形成不定根。

圖5 紅花玉蘭插穗莖基部橫切

圖6 紅花玉蘭插穗莖基部橫切面

2.3 紅花玉蘭扦插生根過程中3 種氧化酶活性變化分析

2.3.1 吲哚乙酸氧化物酶活性變化 IAAO 含量變化影響不定根的形成，在扦插前期，IAAO 活性相對較低，有利于不定原基激活。在紅花玉蘭不定根誘導期，IAAO 活性升高，降低內(nèi)源IAA 水平，與低濃度IAA 有利于生根的觀點不同。由圖7 可知，在扦插過程中清水處理組（CK）和生長調(diào)節(jié)劑處理的紅花玉蘭枝條相比，整體趨勢基本一致，但在個別時間段有差別。扦插后生長調(diào)節(jié)劑處理組IAAO 活性直線上升，到28 d 達到頂峰，隨后急劇下降；清水處理組（CK）IAAO 活性在扦插后前7 d 開始下降然后逐漸升高，到28 d 達到峰值。清水處理組（CK）和生長調(diào)節(jié)劑處理組IAAO 活性在14、21 和28 d 之間差異達極顯著水平。

圖7 紅花玉蘭扦插生根過程中IAAO 活性變化

2.3.2 多酚氧化物酶（PPO）活性變化 由圖8 可知，扦插后生長調(diào)節(jié)劑處理組的PPO 含量遠低于清水處理組（CK），生長調(diào)節(jié)劑處理組在前14 d 呈升高趨勢，14 d 后開始下降，后期變化較小。清水處理組（CK）前14 d PPO 含量迅速升高，至14 d 后又急劇下降，21 d 后緩慢下降。生長調(diào)節(jié)劑處理組在7 d 內(nèi)PPO 含量呈上升趨勢，這個時期PPO 的活性不強，補充生長調(diào)節(jié)劑可能增加生根輔助因子的含量，促進生根。清水處理組（CK）組PPO 活性遠高于處理組，這可能與其沒有外在生長調(diào)節(jié)劑刺激有關，需要啟動體內(nèi)更多的生根輔助因子。在扦插的35 d，清水處理組（CK）和生長調(diào)節(jié)劑處理組插穗的PPO 活性差異顯著，0、14、21 和28 d 差異極顯著。

圖8 紅花玉蘭扦插生根過程中PPO 活性變化

2.3.3 過氧化物酶活性變化 在整個試驗過程中，生長調(diào)節(jié)劑處理組和清水處理組（CK）整體趨勢一致，個別時間有差異。由圖9 可知，生長調(diào)節(jié)劑處理組POD 活性在7 d 時呈下降趨勢，之后持續(xù)增加，28 d 之前增加較緩慢，但在28 d 后快速升高。清水處理組（CK）插穗中過氧化物酶含量在21 d 內(nèi)緩慢升高，21 d 后迅速升高。POD 普遍存在于植物體內(nèi)，可氧化體內(nèi)IAA，在生根前期，POD 活性逐漸上升氧化體內(nèi)過多的IAA，在7 d 時補充生長調(diào)節(jié)劑后，POD 活性最低，可能在生根前期，外源生長調(diào)節(jié)劑含量對POD 活性有一個抑制作用。清水處理組（CK）與處理組間POD 活性分別在21 d 差異顯著，7、28 d 差異極顯著。

圖9 紅花玉蘭扦插生根過程中POD 活性變化

3 討論

3.1 植物過氧化物酶與生根的關系

扦插育苗是一種常用的無性繁殖手段，指在合適的條件下，利用植物枝條、莖、葉或芽培育生根，成長為完整的植株。扦插生根這個生理代謝過程與IAAO、POD、PPO 等酶類有重要關系。植物體內(nèi)吲哚乙酸的水平主要受IAAO 調(diào)節(jié)，IAAO 氧化IAA，IAA 被氧化破壞后，失去活性，降低植物體內(nèi)IAA 含量；另外，POD 也能氧化IAA，從而影響植物的生長。PPO 主要通過催化形成IAA-酚酸復合物來影響木本植物生根，在不定根形成時活性迅速上升，產(chǎn)生高濃度的IAA-酚酸復合物來促進生根。當植物受到損傷或病菌侵染后，PPO 催化酚與O2氧化形成醌，使組織形成褐變，以便恢復損傷，防止感染［28］。本研究結果顯示，紅花玉蘭扦插生根可分3 個階段：前2 個階段要求低活性的IAAO 和POD，有利于維持體內(nèi)較高活性的IAA 促進根的誘導和萌發(fā)；第三階段則相反，高活性的IAAO 和POD 降解高活性的IAA，促進根的生長。本試驗中清水處理組（CK）的PPO活性遠高于生長調(diào)節(jié)劑處理組，較高活性PPO 催化醌形成，促使插穗基部褐化，這也可以解釋清水處理組（CK）中全部插穗出現(xiàn)褐化，而生長調(diào)節(jié)劑處理組僅個別插穗出現(xiàn)褐化這一現(xiàn)象。

本研究結果顯示，插條在愈傷組織形成階段IAAO、POD 活性緩慢上升，PPO 活性呈先升高后降低的變化，但酶活性遠低于清水處理組（CK）組，在28 d 左右，也就是生根后，其IAAO、POD 活性迅速升高，并達到高峰。Wiesman 等［29］認為，在根誘導期，較低的IAAO 活性有利于不定根的發(fā)育，從而促進不定根的生長；說明IAAO 能氧化IAA，通過調(diào)節(jié)IAA 活性來影響生根。IAAO 活性在前期較低，可能是因為插穗本身體內(nèi)含有IAA，所以要外施生長調(diào)節(jié)劑促進插穗吸收，POD 活性在前期升高緩慢，可能與插穗在逆境中生長和愈傷組織的形成有關；PPO 在不定根形成時，活性上升，有可能產(chǎn)生高濃度的IAA-酚酸復合物來促進生根。本試驗中酶活性變 化 與 前 人 結 論［30，31］一 致，與Gyana 等［32］、Klerk等［33］、Caboni［34］的結論不同，說明紅花玉蘭插穗生根需要較高活性的IAA。

3.2 生長調(diào)節(jié)劑與生根解剖結構的關系

根的發(fā)生分為4 個階段：細胞的去分化、誘導階段、根原基發(fā)生、根生長［31］。Caboni 等［34］認為，在生根初始階段，較高的生長調(diào)節(jié)劑水平有利于根原基的形成。張娟等［35］認為，不定根發(fā)源于插穗內(nèi)一些分生組織的細胞群，即根原始體。根原始體進一步分化成根原基，進而發(fā)育成不定根。在不定根形成過程中常伴隨著愈傷組織的發(fā)生，它可以防止病菌入侵，保護傷口不致腐爛，營養(yǎng)物質(zhì)不致流失，為插條生根創(chuàng)造良好條件。在多數(shù)情況下愈傷組織的形成和不定根的發(fā)生是同時發(fā)生，但卻是獨立進行的［36］，這與本試驗觀察的結果一致。Sato 等［37］認為POD影響了生根過程，González等［38］和Caspar等［39］認為PPO 在根形成過程起關鍵作用，它通過控制根再分化過程中前體木質(zhì)素的合成來影響生根。Ilczuk等［9］認為POX、PPO、IAAO 的作用可能在于調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)劑水平，這對促進生根非常必要。

4 小結

紅花玉蘭不定根產(chǎn)生方式有皮部生根和愈傷組織生根兩種，扦插前的紅花玉蘭插穗內(nèi)無潛伏根原基存在，不定根由扦插后形成的誘生根原基發(fā)育而成，其中皮部產(chǎn)生的不定根起源于木質(zhì)部和韌皮部之間維管形成層的薄壁細胞，愈傷產(chǎn)生的不定根是由愈傷組織自己形成的木質(zhì)部外側一些近圓形的薄壁細胞團特化而成。木蘭科植物普遍具有難生根的特性，從目前結果看，紅花玉蘭也屬于難生根的類型。低活性PPO、POD、內(nèi)生高活性IAAO 有利于生根，需要額外補施生長調(diào)節(jié)劑以促進根。目前，關于紅花玉蘭扦插生根的研究較少，今后對于植物的扦插生根機理的研究需要更多的從生理生化、形態(tài)解剖、基因方面開展更深入的研究。