孫永嶺，孫穎慧，趙 宇，李 嬌，冀國(guó)澳，王 瑩

（德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東德州253023）

黃粉蝶亞科(Coliadinae)隸屬于鱗翅目（Lepidoptera），粉蝶科（Pieridae），是蝴蝶中較常見的類群。體中形，色彩較為素雅，多為黃色、橙色或白色，全世界已知11 屬240 種，中國(guó)記載有6 屬38 種。黃粉蝶亞科幼蟲卵化后喜食植物葉片與幼嫩莖稈，對(duì)農(nóng)林業(yè)造成嚴(yán)重危害。迄今為止，我國(guó)黃粉蝶亞科幼蟲及卵在形態(tài)學(xué)上無法進(jìn)行精準(zhǔn)鑒別，即對(duì)有害蝶類昆蟲的鑒定主要依據(jù)其成蟲的外部形態(tài)，但因?qū)⒂紫x飼養(yǎng)到成蟲再鑒別這一階段費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以探討準(zhǔn)確、快速、有效的黃粉蝶亞科鑒定方法很有必要。

近20年來，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)物種鑒定和分類的影響巨大，可以解決傳統(tǒng)分類法無法高效鑒定蝶類昆蟲的問題。經(jīng)典分類學(xué)方法具有局限性，很難快速、有效地對(duì)所得生物樣本進(jìn)行鑒定。因此，2002年Tautz 等人[1]首先提出了DNA 分類的概念。隨后，Herbert[2-3]所提出的線粒體COI 基因指定片段（648bp）為基礎(chǔ)的DNA條形碼（Minimalist-barcode）在新型物種基因鑒定分析方面的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)在學(xué)術(shù)界受到了廣泛關(guān)注。但是DNA條形碼技術(shù)也存在不足，DNA 容易降解這一特性制約了條形碼的適用范圍。當(dāng)樣本質(zhì)量不高，存在DNA 降解情況時(shí)，常常難以獲得完整的DNA 條形碼信息，給不同類物種的有效鑒定工作帶來極大困擾[4]。

微型DNA 條形碼（Minimalist-barcode，簡(jiǎn)寫為mini-barcode）技術(shù)主要是通過對(duì)中國(guó)自然科學(xué)博物館各種鳥類標(biāo)本的DNA 條形碼鑒定設(shè)計(jì)得出的[5]。對(duì)于存在于博物館里面的，且年代比較久遠(yuǎn)的生物標(biāo)本或者化石中的古老物種，由于時(shí)間的流逝，DNA 片段會(huì)丟失或者受到干擾，DNA 條形碼技術(shù)使用會(huì)受到很大限制。因此，Hebert 首次明確地選取了一個(gè)物種的200bp 長(zhǎng)度的條形碼并用來進(jìn)行物種鑒定的微型識(shí)別基因序列，由于在200bp 指定長(zhǎng)度的一個(gè)指定物種序列比較容易無需進(jìn)行擴(kuò)增鑒定即可直接獲得，且通過數(shù)據(jù)采集分析和綜合研究所得到的結(jié)果表明，該物種序列指定長(zhǎng)度的一個(gè)指定物種序列長(zhǎng)度在野外原生物種微型識(shí)別鑒定中也同樣適用，所以Hebert 在論文中明確提出了微型DNA 條形碼這一概念。微型DNA 條形碼技術(shù)是DNA 條形碼技術(shù)的應(yīng)用拓展與補(bǔ)充延伸，通過此種技術(shù)可以更加準(zhǔn)確、便捷的對(duì)蝶類昆蟲進(jìn)行鑒定，為物種鑒定等相關(guān)研究工作提供有力支撐。對(duì)于有害物種的鑒定，傳統(tǒng)的方法存在一定的弊端。同時(shí)，在樣品標(biāo)本的批量采集、運(yùn)輸和保存等各個(gè)方面，也會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本DNA 發(fā)生降解，難以得到完整的DNA 條形碼信息。據(jù)此，本研究以黃粉蝶亞科為研究重點(diǎn)對(duì)象，主要探究并討論微型DNA 條形碼對(duì)黃粉蝶亞科物種在鑒定應(yīng)用方面的實(shí)施性與可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

虛擬實(shí)驗(yàn)中的黃粉蝶亞科36 個(gè)樣本COI 片段序列均來自于BOLD 數(shù)據(jù)庫(kù)(Barcoding of life data)，包括黃粉蝶亞科6 屬38 種36 個(gè)樣本，詳細(xì)序列編號(hào)見附錄1 的3—38；實(shí)體實(shí)驗(yàn)中黃粉蝶亞科的2 個(gè)樣本材料來自山東德州岔河，分別為斑緣豆粉蝶Calias erate 和豆粉蝶Coilas hyale。

附錄1 物種樣本數(shù)量及來源Appendix 1 Origin and amounts of the samples used in this study

1.2 方法

1.2.1 虛擬實(shí)驗(yàn)

將BOLD 數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)下載的黃粉蝶亞科36 個(gè)樣本COI 基因局部序列用Clustal X[6]軟件進(jìn)行比對(duì)，并將比對(duì)之后形成的數(shù)據(jù)集按照?qǐng)D1表示的方式依次進(jìn)行截取，將其截成長(zhǎng)度為648bp、200bp、50bp 幾個(gè)合適的片段數(shù)據(jù)集，分別標(biāo)記為full-barcodeA,full-barcodeB,full-barcodeC，然后用MAGE7.0 軟件對(duì)這3 個(gè)片段數(shù)據(jù)集依次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbor-Joining,Saitou&Nei,1987），參數(shù)為Kimura-2-parameter，再根據(jù)計(jì)算結(jié)果最終得出變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約位點(diǎn)、種內(nèi)差異、種間差異這4 個(gè)數(shù)據(jù)。

1.2.2 實(shí)體實(shí)驗(yàn)

總基因組的提?。簭臉?biāo)本蝴蝶同側(cè)取下1—2 只足，提取總DNA。

①將取下的足剪碎后放入0.2 mL 離心管中依次加入15 μL 提取緩沖液GA（5 mmol/L ）、10 μL（20 mg/mL）的蛋白酶K 溶液，渦旋混勻10 s 后放在56 ℃的溫度下孵育3 h，使樣本充分降解消化，等完成后再次進(jìn)行簡(jiǎn)短離心。

②加入25 μL 緩沖液GA 混勻，再加入50 μL 沖液GB 和1 μL Carner RNA 儲(chǔ)存液，渦旋混勻10 s 后敲擊至沉淀消失，然后進(jìn)行簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。

③加入50 μL 預(yù)冷的無水乙醇，輕輕顛倒混勻后放置5 min 再簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。

④取上清液移至一個(gè)吸附柱CR2 中，以12 000 rpm 離心30 s，棄廢液。

⑤向吸附柱CR2 內(nèi)加入500 μL 的緩沖液GD，再以12 000 rpm 離心30 s，棄廢液。

⑥繼續(xù)向吸附柱CR2 內(nèi)加入600 μL 的漂洗液PW，以12 000 rpm 離心30 s 棄廢液，并重復(fù)一次。

⑦再將材料以12 000 rpm 離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CR2 放置3 min 左右。

⑧將吸附柱CR2 放入1 個(gè)干凈的離心管中，加入20～50 μL 的洗脫緩沖液TB，放置2～5 min 后以12 000 rpm 離心2 min。將溶液收集到離心管中。此時(shí)離心管中的溶液即為提取到的總DNA。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

COI 基因擴(kuò)增引物為 (LEPF1:5’-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’； LEPR1:5’-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)，PCR 反應(yīng)體系總共加入25 μL 溶液，其中各項(xiàng)比例為雙蒸水9.5 μL，mix 12.5 μL，引物L(fēng)EPF11 μL，引物L(fēng)EPR1 溶液1 μL，提取到的DNA1 μL，混合完成后放入離心機(jī)簡(jiǎn)短離心至混勻。將PCR 擴(kuò)增儀設(shè)定為：第1 步預(yù)變性94 ℃5 min；第2 步變性94℃1 min；第3 步退火55℃1 min；第4 步延伸

72℃2 min。重復(fù)以上的2 到4 步30 次，最后在72 ℃下延伸10 min。設(shè)定完成后將混合溶液放入PCR 擴(kuò)增儀，大約擴(kuò)增2 個(gè)小時(shí)22 分鐘。

1.2.4 制膠電泳

按照1:100 的比例進(jìn)行配膠，經(jīng)0.1%低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳切膠分離后，找出所需長(zhǎng)度的DNA 片段，用DNA 凝膠回收試劑盒（Tiangen 公司），作為測(cè)序的模板送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果與虛擬實(shí)驗(yàn)中36 個(gè)樣本序列結(jié)合，以DNA-barcode 指定序列5’端200 bp 為分析基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)為Kimura-2-parameter。

2 結(jié)果與分析

2.1 虛擬實(shí)驗(yàn)

虛擬實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)片段數(shù)據(jù)集full-barcodeA，full-barcodeB，full-barcodeC 的序列解析結(jié)果（見表1），即已算出變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約位點(diǎn)、種內(nèi)差異、種間差異，且以這3 個(gè)片段數(shù)據(jù)集構(gòu)建的NJ 樹分別見圖1-A（648 bp 系統(tǒng)發(fā)育樹）、圖1-B（200 bp 系統(tǒng)發(fā)育樹）、圖1-C（50 bp 系統(tǒng)發(fā)育樹）。

圖1 基于36 個(gè)物種條形碼構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 The Phylogenetic tree based of 36 species

表1 全長(zhǎng)DNA 條形碼與微型DNA 條形碼的對(duì)比Table 1 The compare of DNA barcode and Minimalist-barcode

2.2 實(shí)體實(shí)驗(yàn)

將PCR 擴(kuò)增及測(cè)序得到6 條648 bp 的序列，與虛擬實(shí)驗(yàn)中得到的36 個(gè)樣本序列合并后得到38 條序列的數(shù)據(jù)集，由該數(shù)據(jù)集5’端200 bp 序列構(gòu)建的NJ 樹（見圖2）。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以寬帶紙弄蝶Hasora hurama、沖繩絨毛弄蝶Hasora chromus 為外群，構(gòu)建NJ 樹，并且從NJ 樹上分析。虛擬實(shí)驗(yàn)full-barcodeA 的NJ 樹中（見圖1-A），臺(tái)灣豆粉蝶Eurema alitha、尖鉤粉蝶Gonepteryx mahaguru、黑角方粉蝶Dercas lycorias、檀方粉蝶Dercas verhuelli 位于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近；full-barcode B的NJ 樹中（見圖1-B），無標(biāo)黃粉蝶Eurema brigitta、尖鉤粉蝶Gonepteryx mahaguru、黑角方粉蝶Dercas lycorias、檀方粉蝶Dercas verhuelli 位于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近；full-barcodeC 的NJ 樹中（見圖1-C），尖角黃粉蝶Eurema laeta、黑緣豆粉蝶Colias palaeno、女神豆粉蝶Colias diva、鎦金豆粉蝶Colias chrysotheme、玕黃粉蝶Gandaca barina 位于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近。實(shí)體實(shí)驗(yàn)中，測(cè)序得到的兩種黃粉蝶亞科物種斑緣豆粉蝶Colias erate、豆粉蝶Colias hyale 序列5’端200bp 在NJ（見圖2）樹上得到完全區(qū)分。

圖2 基于38 個(gè)物種條形碼構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 The Phylogenetic tree based of 38 species

在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)被區(qū)分的序列的長(zhǎng)度依次是648bp、200bp、50bp 的時(shí)候，其變異位點(diǎn)在0.913 7 與1 之間，簡(jiǎn)約位點(diǎn)的變動(dòng)區(qū)間在0.897 1 到1 之間，種內(nèi)差異為0.010-0.017，種間差別為0.152-0.191。以上這些數(shù)據(jù)基本上都可以用來表示微型DNA barcode 與完整的barcode 在遺傳距離關(guān)系上起著相似的作用。所以微型DNA 條碼類似于完整的DNA 條碼，且根據(jù)分子進(jìn)化生物學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示物種的種內(nèi)差異在1%～2%之間，種間差異在10%～20%之間[7]，虛擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明full-barcodeB 符合這個(gè)差異范圍，即微型DNA 條碼可以比較方便的去分辨物種。

但是由于目前微型DNA 條形碼使用較少，可靠性還需要大量數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，在動(dòng)物分類學(xué)中有一定的可靠性，但是在其他物種中會(huì)存在很多問題，這些問題需要我們?nèi)ブ饌€(gè)發(fā)現(xiàn)并一一解決，從而使微型DNA 條形碼能夠作為一個(gè)可靠的標(biāo)記基因進(jìn)行物種鑒定。由于微型DNA 條碼序列過短易受其他因素的影響，會(huì)使最后的結(jié)果產(chǎn)生偏離，且在使用微型DNA 條形碼進(jìn)行物種鑒定時(shí)還可能存在種間差異過大的問題，所以想要解決目前存在的問題，還需要科研人員進(jìn)一步去分析解決。