楊海平，咸 洋，韓 彪，王 磊，葛 磊，解孝滿，李文清

（山東省林草種質資源中心，山東濟南250102）

林木種子保存是林業(yè)研究的基礎性、戰(zhàn)略性工作。我國林木種子保存研究發(fā)展緩慢，除了樹木種類繁多、野外采集困難等基本特征外，一個重要原因在于木本植物產生大量頑拗性種子。據(jù)報道，約5%～10%的被子植物種子是頑拗性種子[1]，在熱帶地區(qū)約47%的植物種子為頑拗性種子[2]。頑拗性種子主要是木本植物種子，一般種子體積較大，具有重要的經濟價值，這些種子不耐干燥，無法低溫保存，是公認的世界性難題，頑拗性種子保存技術是林木種子保存研究的重要方向[3]。目前對林木種子頑拗性特征研究尚未取得突破性進展，種子頑拗性產生機理和脫水傷害機制還沒有形成理論體系[4-5]，這是制約林木頑拗性種子保存研究的關鍵問題。

頑拗性林木種子包括橡膠、木薯、油棕等作物；龍眼、荔枝、芒果等熱帶水果；咖啡、桂皮、八角等香(飲)料；板栗、榛子、銀杏等重要經濟林；殼斗科、棕櫚科等用材和觀賞林[6-7]。鑒于頑拗性種子保存對國民經濟發(fā)展的重要性，其頑拗性形成機理和保存技術研究顯得迫切而重要。林木頑拗性種子為人類提供了許多寶貴的資源，相關研究成果已成為種子研究和科普的重要方向[8-9]。

1 頑拗性種子的概念和分布

1.1 種子頑拗性概念產生

Roberts[10]根據(jù)植物種子保存特性將種子劃分為頑拗性種子（recalcitrant seeds）和正常性種子（orthodox seeds）。Farrant[11]提出植物種子頑拗性是連續(xù)的群體，存在低度、中度、高度等不同類型。Ellis[12]認為頑拗性種子和正常性種子之間還存在中間性種子（intermediate seeds）。設施保存庫低溫保存正常性種子的理論基礎是種子生命力方程，而頑拗性種子的存在則為種子保存行為提出了嚴峻挑戰(zhàn)。研究表明，頑拗性種子具有脫水敏感性，大多數(shù)頑拗性種子在成熟脫落時依然保持較高的含水量，這類種子輕度脫水后種子活力顯著下降[13]，頑拗性種子無法在低溫和低濕的環(huán)境下長期保存，因此種子保存庫無法保存這類種子，這使得頑拗性種子成為種子保存研究的熱點問題[14,15]。

1.2 頑拗性種子種類和分布

頑拗性種子主要是多年生木本植物的種子及少量水生植物的種子。Farnsworth[16]根據(jù)文獻資料，發(fā)現(xiàn)有195 種植物種子屬于頑拗性種子，分屬78 個科和195 個屬；Mayrinck[17]比較了巴西生物多樣性熱點地區(qū)30科79 種植物種子，發(fā)現(xiàn)47.4%的物種產生正常性種子，19.2%產生中間性種子，33.3%產生頑拗種子。劉明航[9]根據(jù)英國皇家植物園邱園（KEW）種子信息網站公布的種子信息，整理了24781 份種子信息，其中620 種頑拗性種子，149 種中間性種子，23472 種正常性種子，540 種不確定，頑拗性種子和中間性種子約占統(tǒng)計數(shù)量的3.1%。產生頑拗性種子的植物多分布于熱帶，溫帶的頑拗性種子主要集中在殼斗科和槭樹科，大多數(shù)科的植物種子保存類型通常包括2 種(頑拗、正常)或3 種(頑拗、中間、正常)類型[18]，因此種子的保存特征和其所屬的科屬無必然的聯(lián)系，沒有明顯的系統(tǒng)分類學特征[19]。Tweddle[20]對不同生境條件下植物種子特性研究，發(fā)現(xiàn)溫帶地區(qū)的517 種草本植物種子僅0.2 %的種類不耐脫水，但是886 種木本植物種子有18%的植物種子在干燥后失去活力。處于不同生境的同一物種，其脫水耐受性亦有差別，Chen[21]對西南地區(qū)野生茶樹（Camellia sinensisL.）脫水耐性的研究表明，不同生境茶樹種子脫水耐性存在明顯差異。Tweddle[20]對93 科886 種喬（灌）木的種子進行研究表明，在熱帶及亞熱帶地區(qū)，常綠雨林47%為脫水敏感性物種，而熱帶沙漠和半沙漠地區(qū)僅2%； 在溫帶地區(qū)，濕潤的溫帶森林有23%是頑拗型種子，溫帶沙漠及半沙漠地區(qū)幾乎沒有頑拗性物種。

2 頑拗性種子特征

2.1 頑拗性種子的基本特征

文彬[14]把種子頑拗性的特征劃分為種間、種內和個體發(fā)育3 個層面，提出種子頑拗性是一種復合性狀，其核心性狀包括耐脫水、耐低溫及耐保存等方面的內容，頑拗性的伴隨性狀包括種子大小、千粒重、含水量、休眠特性、分類地位、地理分布和保護性物質含量等多方面的內容。Berjak[22]認為不同植物的種子具有不同程度的頑拗性，頑拗性與正常性不是絕然分開的，而是逐漸過渡的，構成一個種子頑拗性的連續(xù)譜，頑拗性種子和正常性種子位于這個連續(xù)譜的兩端。就單一物種而言，其種子頑拗性特征應該包括脫水敏感性特征、形態(tài)結構特征、細胞成分特征和分子生物學特征等方面[8,23]。

2.2 脫水敏感性與臨界含水量

種子頑拗性不僅在不同科、屬、種之間存在差異，同一物種在不同實驗室有時也會得到不同的結論，例如印度苦楝種子曾被劃為頑拗性種子、中間性種子和正常性種子[24-25]。茶[26-27]、小?？Х萚12]、野生稻[28]種子保存特性也有不同的報道。頑拗性種子在不同發(fā)育階段脫水耐性亦存在差異，板栗[29]、蒲葵[30]等頑拗性種子在成熟前存在一個脫水耐性相對較高的階段，但是總體而言，這些種子在整個發(fā)育過程中大部分時間對脫水敏感。由于不同實驗室、不同研究人員對種子（胚）脫水處理方法不同，導致脫水耐性存在較大差異，PEG 滲透脅迫、ABA 預培養(yǎng)、脫水速度、梯度蔗糖培養(yǎng)等都可以用來誘導和提高一些頑拗性種子的脫水耐性[31]，因此，建立標準的頑拗性種子脫水技術是未來研究頑拗性種子脫水耐性的重要技術手段。

頑拗性種子特征與含水量具有重要的聯(lián)系，研究表明，頑拗性種子含水量一般較高，成熟期的含水量分布范圍約為36%～90%[32]。林木頑拗性種子脫水臨界含水量一般較高，含水量下降時，會導致種子脫水傷害。頑拗性種子內部水分多為自由水，這些自由水維持了細胞旺盛的代謝水平[33]。有些頑拗性林木種子如山紅樹和望天樹，種子含水量很高，本身含水量足以保證萌發(fā)，亦無萌發(fā)限制因素，種子脫離母株前就可以萌發(fā)，而多數(shù)頑拗性種子脫落之后，在少量降雨后或濕潤生境中可以自由萌發(fā)[13,34]。頑拗性種子在成熟時多保持較高含水量，對脫水和低溫敏感，是其無法長期保存的重要因素[5,35]。目前，已有一些使用差示掃描量熱（DSC）技術分析種子內部水分熱力學特征的報道，Hamilton[36]使用DSC 分析了澳大利亞3 種野生植物（C.australasica，C.inodora，C.garrawayi）不同含水量種子熱力學特征，Al[37]利用DSC 測定了長葉金柑（Fortunella polyandra）種子的臨界含水量。綜上所述，使用DSC 等新技術結合種子（胚）萌發(fā)率測定，能夠對種子脫水敏感性和臨界含水量進行鑒定，這將是頑拗性種子研究的重大創(chuàng)新，具有較好的應用前景。

2.3 頑拗性種子形態(tài)特征

Cerabolini[38]認為種子脫水耐性及保存壽命與種子形態(tài)特征有關。Pritchard[34]通過對南洋杉科和龍腦香科頑拗性種子與正常性種子的比較，發(fā)現(xiàn)頑拗性種子表面積與體積比值較小。Daws[6]發(fā)現(xiàn)正常性種子的種皮比頑拗性種子的種皮厚，頑拗性種子的種皮在整個種子所占的比重小。同屬植物中，頑拗性種子一般大于正常性種子，Gleiser[39]對46 種槭屬植物種子研究表明，正常性種子千粒重一般小于頑拗性種子千粒重。Hong[32]對23 種殼斗科植物種子進行分析，發(fā)現(xiàn)16 種正常性種子千粒重小于7 種頑拗性種子千粒重。Xia[40]對頑拗性櫟屬植物種子研究發(fā)現(xiàn)，櫟屬植物果皮形態(tài)解剖特征決定了果實水分進出的速率，形態(tài)特征對水分的保持具有重要意義。Walters[41]在研究頑拗性種子脫水時發(fā)現(xiàn)，脫水過程中細胞難以形成穩(wěn)定的空間結構，進而影響細胞的功能。Wesley-Smith[42-43]對植物Acer saccharinum低溫保存的胚軸超微結構進行觀察時認為，細胞在低溫條件下的結冰現(xiàn)象是影響種子保存活力的重要影響因素，細胞內冰晶會造成細胞的物理傷害，進而導致細胞自噬降解，并可能引起程序性細胞死亡。韋樹根[23]對桑寄生頑拗性種子脫水后形態(tài)結構研究時發(fā)現(xiàn)，種子脫水過程中細胞器受到損傷，線粒體的形態(tài)結構破裂，核仁逐步降解，脂肪體及淀粉粒分解劣變。目前，頑拗性種子形態(tài)特征研究多集中在種子整體形態(tài)特征或者胚軸細胞透射電鏡分析，還缺乏細胞群體層面的觀察和測定，因此需要對脫水過程中細胞群體形態(tài)變化效應進行分析，從而更加全面的了解頑拗性種子脫水過程中產生的細胞形態(tài)變化。

2.4 頑拗性種子分子機制研究

目前，關于頑拗性種子形成的分子機制尚無成熟的理論體系，但是不同的學者從不同的角度進行了研究。頑拗性種子含水量較高，種子脫水過程中其內部活性氧自由基（ROS）的含量逐漸增加，ROS 清除系統(tǒng)的活性與頑拗性產生具有密切聯(lián)系[44-46]。茶樹頑拗性種子減少活性氧自由基可以顯著降低種子脫水過程引起的損傷，提高種子萌發(fā)率[27]。因此，研究抗氧化系統(tǒng)調節(jié)對頑拗性種子形成機制研究具有重要意義。研究顯示，正常性種子的脫水耐受性獲得與應激防御相關基因的表達上調有關，這些基因包括胚胎后期豐富蛋白（LEA）、抗氧化系統(tǒng)和代謝途徑[47]。頑拗性種子在脫水過程中抗氧化系統(tǒng)活力下降和脂質過氧化是種子活力喪失的重要表現(xiàn)[48]，Chen[49]進一步指出，磷脂酶Dα1 介導的細胞膜磷脂酸的變化是脫水誘導種子活力喪失的關鍵決定因素。袁支紅[50]和Sunderlikova[51]分別使用cDNA-AFLP 技術分別對茶樹和橡膠頑拗性種子脫水過程中的差異基因進行研究，發(fā)現(xiàn)脫水過程中的部分差異基因與擬南芥衰老蛋白有很高的同源性，并發(fā)現(xiàn)了一些脫水相關基因。Kalemba[52]對槭屬3 種正常性種子和頑拗性種子脫水后的差異蛋白分析，發(fā)現(xiàn)了一個小熱休克蛋白在脫水過程中高度表達。

劉迪[53]認為種子頑拗性形成與小熱激蛋白（HSPs）和胚胎后期豐富蛋白（LEA）具有一定關系。李磊[15]指出正常性種子脫水耐性的獲得和保留與LEA 蛋白家族中的D-Ⅱ家族（脫水素）有著密切的關系。正常性種子脫水時，由于LEAs 蛋白的親水性，在細胞內部結構和大分子周圍形成了一層具有保護作用的水態(tài)膜，從而使種子具有脫水耐性[54]。Julien[55]在對栗豆樹（Castanospermum australe）頑拗性種子的研究中認為LEA 的缺乏可能是造成其脫水敏感性的重要原因，文彬[14]在分析大量研究的基礎上，認為LEA 蛋白與脫水敏感性具有緊密聯(lián)系，但是不能簡單的歸類為有和無的區(qū)別。目前尚無充分證據(jù)顯示種子頑拗性與缺乏某種蛋白相關，也缺乏頑拗性種子不同含水量梯度下蛋白質數(shù)量和質量差異的系統(tǒng)研究，因此需要對頑拗性種子脫水過程中不同含水量種子（胚軸）蛋白質組的變化進行測定，找出關鍵差異蛋白，并研究關鍵差異蛋白在脫水過程中的作用，從而為揭示種子頑拗性的分子機制提供理論依據(jù)。

3 頑拗性種子保存技術

3.1 低溫保存

頑拗性種子短期貯存方法有氣調法、吸漲保存法、水浸保存法、部分脫水室溫保存法等。這些方法主要是在保持種子活力的前提下，將其保存在所能承受的最低溫度下，避免水分喪失，并防止微生物的侵染，可使頑拗性種子的壽命延長至數(shù)月，甚至數(shù)年[56]，如頑拗性種子Trichilia dregeana在生長期未完成前脫落，能在16℃的最佳保存條件下保存數(shù)月，才出現(xiàn)明顯的萌發(fā)狀態(tài)[57]，具有休眠特性的頑拗性種子龍眼和三七等可采用層積砂藏保存，在休眠期內為種子提供水分，短期內能夠保持種子活力[15]。但是這些短期保存方法因種而異，頑拗性種子由于耐脫水和耐寒程度不同，因此尚無適用所有頑拗性樹種的短期保存方法。

3.2 超低溫保存

頑拗性種子沒有規(guī)范性的長期保存方法，目前使用較多的是液氮保存法，在低含水量下，種子能保存在-196℃下不受傷害。由于大部分頑拗性種子個體大，脫落時含水量高，而大粒的林木頑拗性種子難以快速脫水，而緩慢脫水和降溫會對種子產生致命傷害，小粒的頑拗性種子已有超低溫保存報道，這類種子容易快速脫水，如印度楝（Azadirachta indica）頑拗性種子的超低溫保存[58]。對于體型過大的林木頑拗性種子，需切取離體胚軸作為外植體進行超低溫保存，Wen[59]和Wen[60]先后對蒲葵（Livistona chinensis）胚軸進行超低溫保存條件篩選和超低保存試驗，發(fā)現(xiàn)超低溫保存2年后，胚的活力幾乎無改變。韓彪[61]對板栗離體胚軸組織進行進行不同超低溫保存方法比較，發(fā)現(xiàn)PVS2 溶液可以提高超低溫保存后胚軸成活率。近年來林木頑拗性種子超低溫保存技術研究關注點集中于如何快速降低種子（胚）含水量、降低脫水過程中的氧化脅迫傷害，以及部分脫水、快速冷凍、后續(xù)加溫等過程中如何避免種子傷害的問題[62-63]。但是總體而言，頑拗性種子超低溫保存還存在許多瓶頸問題，大部分頑拗性種子超低溫保存仍然處于探索試驗階段，低溫保存后形成植株也相對困難[23,64]，需要針對不同物種，研究適合的脫水條件和超低溫保存與恢復條件，而后總結規(guī)律，形成一套頑拗性種子超低溫保存的技術體系。

4 頑拗性種子研究展望

人類基于生產生活需要，根據(jù)保存類型的差別將種子分為頑拗性種子、中間性種子、正常性種子，頑拗性種子與正常性種子是一種連續(xù)的存在。未來頑拗性種子的研究方向應該主要包括兩個方面，一是種子頑拗性機理研究，這將是一項綜合性的研究，涵蓋林學、植物學、種子科學、分子生物學等多學科交叉研究。二是保存技術研究，目前頑拗性種子的低溫保存和超低溫保存關鍵技術還不是很成熟，雖然有個別物種的成功案例，但是沒有可推廣應用的技術體系。因此，需要不同研究領域的科學家共同合作，將機理研究和保存技術研究協(xié)同攻關，才能真正解決這一問題。