李 錦，李 晶，李娜娜，陳 寧，孟 巖，潘亭亭，張蔓麗，朱 軍，田亞平 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部 出生缺陷防控技術(shù)研究中心，北京 00853； 四川大學華西第二醫(yī)院 國家出生缺陷監(jiān)測中心，四川成都 60000

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝病，由苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydrozylase，PAH)活性的部分或完全缺失引起，會使苯丙氨酸在體內(nèi)蓄積，導致患兒出現(xiàn)多系統(tǒng)損害[1-3]。PAH基因編碼苯丙氨酸羥化酶，該基因突變可引起酶活性異常[1-3]。世界范圍內(nèi)，PKU發(fā)病率在性別上無統(tǒng)計學差異，但突變種類和頻率存在明顯地域和種族差異。美國白種人新生兒PKU發(fā)病率為1∶10 000，土耳其新生兒PKU發(fā)病率為1∶2 600，為全世界最高；芬蘭和日本的新生兒PKU發(fā)病率最低，不足1∶100 000[4-6]。1985-2018年中國大陸研究顯示PKU發(fā)病率為1∶11 144～11 614，且呈現(xiàn)“北高南低”趨勢[7-13]。另外，歐美白種人PKU常見突變位點位于外顯子12和內(nèi)含子12，而中國大陸人群常見突變位點位于外顯子7、外顯子6和外顯子12。可見PKU致病基因PAH的高度異質(zhì)性[7-13]。突變種類和頻率存在明顯地域和種族差異，因此針對不同地域的基因突變檢測是有必要的。PAH基因定位于常染色體12q23.2[14]。目前PAH突變數(shù)據(jù)庫中已收錄了100多種致病突變位點(http://www.biopku.org/pah)，突變類型多樣，包含錯義突變和無義突變(65.4%)、小缺失(11.2%)、剪切位點突變(12.8%)以及小插入(2.3%)。我國吉林、遼寧兩省PAH 基因突變情況尚無相關(guān)報道。本文對80例患兒進行PAH基因1～13號外顯子及其側(cè)翼序列的一代測序，檢測到的突變位點在患兒家系中進行驗證，而后行突變位點分析，了解其突變特征。

對象與方法

1 研究對象 選取2016 - 2018年在吉林省婦幼保健院、長春市婦幼保健院、延邊州幼保健院、松原市婦幼保健院、四平市婦幼保健院、白城市婦幼保健院、遼寧省婦幼保健院確診為苯丙酮尿癥的患兒及家系為研究對象。研究對象入選要求：1)血液及尿液標本進行苯丙氨酸濃度測定、血二氫蝶呤還原酶測定、BH4負荷試驗(Phe濃度＞600 μmol/L)或Phe和BH4聯(lián)合負荷試驗(Phe濃度 ≤ 600 μmol/L)、尿蝶呤譜分析，確認治療前血液苯丙氨酸濃度持續(xù)高于120 μmol/L，且排除四氫生物蝶呤缺乏癥、一過性高苯丙氨酸血癥和酪氨酸血癥。2)年齡0～10歲。該實驗已通過中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理審查，所有受試者患者及家長均簽署知情同意書。對患兒進行PAH基因1 ～ 13號外顯子及其側(cè)翼序列一代測序，檢測到的突 變位點在患兒家系中進行一代測序驗證。

2 樣本采集及DNA提取 采集患兒及父母外周靜脈血2 mL，按照QIAamp?DNA Blood Mini Kit操 作流程提取樣本基因組DNA。

3 PCR擴增及一代測序 PAH基因1～13號外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列引物序列見表1，PCR擴增條件及體系見表2，PCR產(chǎn)物純化按照OMEGA?Cycle-Pure Kit說明書操作進行純化，測序采用T hermoFisher?3500DX基因分析儀。

表1 PAH基因外顯子1～13引物序列Tab. 1 Primer sequences for PKU exons 1 - 13

表2 PCR反應條件體系和擴增條件Tab. 2 PCR amplification system and amplified conditions

4 突變命名及驗證 結(jié)合BIOPKU數(shù)據(jù)庫(http://www.biopku.org/pah)命名已知突變點，新的突變點通過對比數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nig.gov)和BIOPKU確定為新突變。新突變命名依據(jù)HGVS命名規(guī)則(http://www.hgvs.org/mutnomen)。c代表編碼蛋白的DNA序列，p代表蛋白質(zhì)序列 ，參考序列為 NM_000277.3。

5 突變位點的蛋白功能預測 將突變的氨基酸序列輸入到在線軟件PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)和SIFT (http://sift.jcvi.org)，軟件自 行進行突變位點的蛋白功能預測。

6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意 義。

結(jié) 果

1 該 地 區(qū)PAH基 因 突 變 頻 率 最 高 的 位 點為R243Q 共納入80例PKU患兒，其中男32例，女48例。我們將80例PKU患兒PAH基因外顯子1 ～ 13的一代測序序列，與GenBank cDNA(GI：209364518)進行比對，而后對患者家系進行突變位點的家系驗證。80例患者中15例為純合子，64例為復合雜合子，1例為三個雜合子，共檢測292個等位基因(表3、表4)。結(jié)果顯示，有3個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)[Q232(CAA＞CAG)、V245V(GTG＞GTA)及L385L(CTG＞CTC)]；發(fā)現(xiàn)了161個突變位點，占292個突變等位基因的55.14%，46種突變類型(41種集中在外顯子區(qū)域，余5種位于內(nèi)含子區(qū)域)?；颊咄蛔冾l率最高的位點為R243Q(15.75%)，其次為IVS11-3A＞T(4.11%)、R413P(3.42%)、IVS4-1G＞A(3.08%)、EX6-96A＞G(3.08%)、Y356*(2.74%)、R111*(2.74%)、R241C(2.4%)、R53H(1.03%)、IVS2 +19T＞C(1.03%)。余36種突變類型突變頻率小于1%。在46種突變位點中，有29種為錯義突變、7 種剪切位點突變、5種無義突變和5種小缺失。

表3 吉林和遼寧省80例患兒PAH基因外顯子1～13突變點匯總Tab. 3 PAH 1-13 exon mutations in 80 cases from Jilin and Liaoning province

表4 80例患兒PAH基因突變點詳表Tab. 4 Mutations identified in 80 PKU patients

2 F294S為PAH基因新發(fā)現(xiàn)的突變點。 我們在吉林1個家系樣本中發(fā)現(xiàn)了新的突變位點F294S(表4、圖1)，該位點之前未見報道過，其余突變位點均已被收錄在 PAH Mutation Analysis Consortium Database (HGMD)數(shù) 據(jù) 庫 中。依據(jù)ACMG發(fā)布的《遺傳變異分類標準與指南》進行評估。該位點為錯義突變，附近的51對堿基所報道的變異有16個致病性0個良性變異，位于已知無良性變異的關(guān)鍵功能域，符合證據(jù)PM1。在gnomAD外顯子和基因庫中均未記錄該變異位點，人群數(shù)據(jù)庫中缺失，符合證據(jù)PM2。苯丙酮尿癥為常染色體隱形疾病，該患者確證為苯丙酮尿癥，且經(jīng)一代驗證患者F294S突變?yōu)楦冈赐蛔?，另一突變點R111*為母源突變，符合證據(jù)PM3。此外，我們分別用在線軟件PolyPhen-2和SIFT進行突變位點的蛋白功能預測，PolyPhen-2結(jié)果顯示為Probably Damaging(很可能損害)，Hum Var結(jié)果的分數(shù)越接近1.0，損害的可能性就越大(圖2)；SIFT結(jié)果顯示Damaging(有害)(圖3)，符合證據(jù)PP3。該突變點符合3個中等(PM1、PM2、PM3)和1個支持(PP3)證據(jù)，依據(jù)指南，目前致病性評估為可能致病(likely pathogenic，LP)。

圖1 F294S一代測序驗證結(jié)果A：患兒F294S電泳結(jié)果：Exon8 c.881T > C，p.F294S，雜合突變；B：患兒父親相同位點一代驗證電泳結(jié)果：Exon8 c.881T> C，p.F294S，雜合突變；C：患兒母親相同位點一代驗證電泳結(jié)果，為野生型Fig.1 Sanger Sequencing results of the F294S mutation A: The electropherogram of the patient sample shows one adenine nucleotide missense mutation in a heterozygotea manner; B, C: The electropherogram of the patient's father and mother samples, respectively

圖2 PolyPhen-2對突變點的預測Fig.2 This mutation is predicted by PolyPhen-2

圖3 SIFT對突變點的預測Fig.3 This mutation is predicted by SIFT

討 論

迄今，人類有8000余種單基因病被發(fā)現(xiàn)，其中由PAH基因突變導致的PKU是中國最常見的新生兒單基因遺傳代謝病之一[15]。目前尚無方法可以根治PKU，最常見的方法是在新生兒篩查中做到“早發(fā)現(xiàn)早治療”，減少對患兒生長發(fā)育及智力發(fā)育等方面損害。因此快速、有效、精準的基因診斷對PKU患兒的盡早治療十分有意義。PAH基因的突變類型有明顯的地域和種族差異，因此針對不同地區(qū)的PKU患兒發(fā)現(xiàn)當?shù)豍AH基因突變特點，尋找突變熱點，有助于患兒的早期診斷，對患兒家族的再生育有指導意義。

在此次檢測中，我們檢測了80例來自吉林遼寧省的PKU患兒家系，發(fā)現(xiàn)了46種突變類型，其中R243Q突變頻率最高(15.75%)，隨后是

IVS11-3A＞T、R413P、IVS4-1G＞A和EX6-96A＞G(4.11%、3.42%、3.08%、3.08%)。歐美白種人PAH常見突變位點位于外顯子12(R408W)和內(nèi)含子12(IVS12 + 1G＞A)[16-17]；亞洲國家，伊朗突變熱點IVS10-11G＞A[18]，日本常見突變位于R413P、R243Q和R241C[19]，朝鮮主要類型為IVS4-1G＞A和R243Q[20]，中國臺灣最常見的PAH突變是R241C(36%)[21]。本研究人群的突變熱點依然位于外顯子7(R243Q)，這也支持之前研究的結(jié)論，與前期中國大陸的突變位點南北差異趨勢相符，中國大陸人群常見突變位點位于外顯子7、外顯子12和外顯子6(R243Q、EX6-96A＞G、V399V、R241C、R111*、Y356*、R413 P和IVS4-1G＞A)[22-23]。但此次研究的R241C(2.4%)高于IVS7 + 2T＞A(0.34%)，與以往研究略有不同。在此前研究中R241C，R408Q和p.Y166*南方人群略高，推測可能與觀測樣本量的數(shù)目有關(guān)。在致病性突變中，與無義突變、剪切位點突變、小缺失、小插入和大片段缺失相比，錯義突變?nèi)允亲畛Ｒ姷闹虏⊥蛔?。本組觀察到46種突變，有29種為錯義突變，這一點與前期研究相符。

此外我們發(fā)現(xiàn)了PAH基因一個新的突變位點F294S，該位點未在BIOPKU數(shù)據(jù)庫中記錄。突變點F294S位于8號外顯子，為錯義突變，編碼區(qū)c.881核苷酸由胸腺嘧啶(T)變?yōu)榘奏?C)，引起第294號氨基酸錯義突變，由苯丙氨酸(phenylalanine/phethe)變?yōu)榻z氨酸(serine/ser)，該位點所在區(qū)域為無良性變異的功能域，極有可能引起苯丙氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)改變和酶活性降低。目前我們依據(jù)ACMG發(fā)布的《遺傳變異分類標準與指南》進行評估，該位點為可能致病，后續(xù)隨著病例積累，如該位點頻率顯著高于對照，可符合證據(jù)PS4；完善功能研究表明有害作用，可符合證據(jù)PS3；已完整鑒定的致病變異有相同氨基酸改變，符合證據(jù)PS1。符合上述其中的一條，該變異致病性可上升為致病。

目前吉林、遼寧兩省PAH基因突變情況還沒有報道過。本研究只是針對PAH基因進行一代測序檢測，顯示點突變、小缺失/插入/重復，對于PAH基因大片段缺失無法檢測到，可繼續(xù)補充MLPA檢測方法；新的突變點可以進行功能驗證。盡管PKU無法治愈，目前公認早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以延緩病情進展[24]。患兒出生后通過嚴格的飲食限制或飲食結(jié)合藥物治療，將外周血苯丙氨酸濃度控制在正常水平，不會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[25]。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)吉林、遼寧地區(qū)80例PKU患兒PAH基因的突變特點，同時發(fā)現(xiàn)一個新的突變位點F294S，為該地區(qū)預防PKU出生缺陷提供了一定的參考。