潘燕芳 孫奇 李秋云 姜海雅

結(jié)直腸癌的發(fā)病初期具有隱秘性，但是隨著病情發(fā)展會逐漸出現(xiàn)一系列癥狀。據(jù)不完全數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌占據(jù)大腸疾病70%左右，結(jié)直腸癌的發(fā)病與飲食及外部環(huán)境相關(guān)，攝入大量高脂肪會加快結(jié)直腸癌的發(fā)生[1，2]。結(jié)直腸癌病變的主要位置在直腸與乙狀結(jié)腸交匯處，早期無顯著臨床特征，出現(xiàn)腹痛等癥狀多為進(jìn)展性病情，因此，提前預(yù)防、及時治療十分重要。結(jié)直腸癌的產(chǎn)生、進(jìn)展和多種基因密切相關(guān)[3，4]。Ki67蛋白是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核蛋白，可反映細(xì)胞的增殖情況，并且是重要腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)記物，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Ki67是國內(nèi)臨床病理檢測使用廣泛的腫瘤增殖標(biāo)志物，在細(xì)胞核中表達(dá)，往往與患者預(yù)后相 關(guān)[5]。DCLK1對消化系統(tǒng)有一定的影響，有研究發(fā)現(xiàn)DCLK1在胃癌組織中較癌旁組織及正常組織中陽性發(fā)生率高，表明其與胃癌的預(yù)后有直接關(guān)系[6]。因此，現(xiàn)對DCLK1、Ki67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床特征進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料隨機(jī)選取2018年2月～2020年1月我院收治的結(jié)直腸癌患者100例，男女各50例，年齡38～71歲，中位年齡（47.35±9.16）歲；高分化18例、中分化51例、低分化31例。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合結(jié)直腸癌的臨床診斷；②病理學(xué)、分子生物學(xué)等資料均完整；③嚴(yán)格遵循本研究要求接受手術(shù)、病理學(xué)檢查，保證本次研究結(jié)果高度準(zhǔn)確；④入組前未接受任何放療等治療方法，其中診斷性手術(shù)除外。

排除標(biāo)準(zhǔn):①非結(jié)直腸癌患者且資料收集不完整者；②DCLK1、Ki67檢測結(jié)果不明確，無法判定結(jié)果者；③精神疾病者；④存在嚴(yán)重機(jī)體器官功能障礙及對本研究存在禁忌者。

1.2 方法本組手術(shù)患者均經(jīng)病理科明確診斷為結(jié)直腸癌，收集結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化技術(shù)予以DCLK1、Ki67檢驗，其檢驗過程如下:將結(jié)腸癌組織切開于中性福爾馬林溶液中充分固定，按病理組織取材標(biāo)準(zhǔn)取材，脫水、包埋后，防脫片切片，烤片機(jī)烤片，65℃烤2h備用，按照LEICA BOND-MAX規(guī)范流程上機(jī)染色，一抗孵育20min，封片。DCLK1及Ki67購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DCLK1染色結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)：蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量<10%為陰性，≥10%為陽性，50%～75%為強(qiáng)陽性，≥75%為極強(qiáng)陽性。Ki67染色結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)：①按陽性細(xì)胞數(shù)記分：陽性細(xì)胞數(shù)≤14%記為0分，15%～25%記為1分，26%～50%記為2分，>50%記為3分；②按染色強(qiáng)度記分：無顏色記為0分，淺黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分；最終染色結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)為①+②≤1分為陰性，≥2分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件分析，計數(shù)指標(biāo)用n（%）表示，行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCLK1、Ki67陽性表達(dá)率DCLK1、Ki67陽性表達(dá)率分別為43.0%（43/100），55.0%（55/100）。

2.2 DCLK1、Ki67與結(jié)直腸癌患者的病理特征關(guān)系腫瘤直徑≥5cm，腫瘤腸壁侵襲漿膜外及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的DCLK1及Ki67陽性表達(dá)率較高（P<0.05）。且DCLK1及Ki67與腫瘤直 徑、腫瘤腸壁侵襲部位、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性，其中腫瘤直徑由小變大存在DCLK1、Ki67表達(dá)升高趨勢，Pearson分析（r=0.197、P=0.049，r=0.242、P=0.015），腫瘤腸壁侵襲由黏膜層到黏膜外存在DCLK1、Ki67表達(dá)升高趨勢，Pearson分析（r=0.260、P=0.009，r=0.257、P=0.014）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移由無到有存在DCLK1、Ki67表達(dá)升高趨勢，Pearson分析（r=0.231、P=0.021，r=0.227、P=0.023）。結(jié)直腸癌患者腫瘤不同分化程度、不同TNM分期的DCLK1、Ki67表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且腫瘤分化程度由高分化向低分化存在DCLK1、Ki67表達(dá)升高趨勢，Pearson分析（r=0.638、P=0.012，r= 0.522、P=0.019）；TNM分期由Ⅰ期向Ⅳ期DCLK1、Ki67表達(dá)呈升高趨勢（r=0.418、P=0.026，r=0.402、P=0.028）。見表1。

表1 DCLK1、Ki67與結(jié)直腸癌患者的病理特征關(guān)系[n（%）]

2.3 DCLK1、Ki67表達(dá)對預(yù)后的影響DCLK1陽性表達(dá)患者1年生存率為76.74%（33/43）低于陰性表達(dá)患者的92.98%（53/57），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.368，P=0.021）；Ki67陽性表達(dá)患者1年生存率74.55%（41/55）低于陰性表達(dá)患者的91.11%（41/45），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.602，P=0.032）。

3 討論

早期直腸癌患者通過手術(shù)治療可以痊愈，但是有些患者有臨床癥狀時為進(jìn)行病變期，目前術(shù)前采用放化療可減小患者病灶面積，利于手術(shù)成功。對直腸癌患者根據(jù)病理程度進(jìn)行TNM分期，有利于患者預(yù)后，大量臨床資料表明DCLK1、Ki67表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后有明顯的關(guān)系[7，8]，并應(yīng)用于臨床指標(biāo)觀察，因此本研究通過對100例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行DCLK1、Ki67表達(dá)檢測，探討其對病理分期及預(yù)后的影響。

DCLK1為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志，有國外研究學(xué)者以選擇性消除DCLK1陽性細(xì)胞的方式進(jìn)行動物模型實驗，發(fā)現(xiàn)抑制癌細(xì)胞生長的微小RNA-144含量增加，而促使腫瘤發(fā)生的腫瘤干細(xì)胞基因、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平均下降，提示DCLK1可經(jīng)上述因素參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。研究證明，通過抑制結(jié)腸癌患者癌細(xì)胞內(nèi)DCLK1表達(dá)后，患者的成瘤性顯著下降，提出DCLK1和結(jié)直腸癌發(fā)生密切相關(guān)[10]。Ki67作為增殖性抗原標(biāo)志物被首次認(rèn)知，并在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，其生物活性廣泛，其抗原屬于核酸蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖，在細(xì)胞核中增多，是細(xì)胞繁殖的基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)表示，Ki67與細(xì)胞基因RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，其抗原活性降低能夠?qū)е翿NA合成受限[8]。在結(jié)腸癌疾病中，Ki67是評估癌細(xì)胞活性應(yīng)用強(qiáng)度最高的分子指標(biāo)[7]。Ki67在結(jié)腸癌細(xì)胞（除G0期）周期中顯著表達(dá)，在M期表達(dá)最高，能夠成為診斷結(jié)腸癌疾病的早期預(yù)測指標(biāo)之一。早期結(jié)腸癌組織中Ki67呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)往往意味著患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移風(fēng)險更大[11]。研究表明檢測結(jié)腸癌患者組織標(biāo)本的Ki67水平，發(fā)現(xiàn)其水平與患者腫瘤直接相關(guān)，對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[12]。因此結(jié)直腸癌早期診斷Ki67陽性表達(dá)率對控制病情具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)DCLK1、Ki67陽性表達(dá)率分別為43.0%（43/100）、55.0%（55/100），腫瘤直徑≥5cm、腫瘤腸壁侵襲漿膜外、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度低以及腫瘤分期高的患者DCLK1、Ki67陽性表達(dá)率高。且DCLK1、Ki67在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)與患者腫瘤直徑、腸壁侵襲位置、轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度和TNM分期呈正相關(guān)。表示隨著結(jié)直腸癌的發(fā)展，患者DCLK1及Ki67陽性表達(dá)率越高。同時，隨著病情進(jìn)展，DCLK1、Ki67陽性表達(dá)率高的患者其腫瘤直徑大，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高。DCLK1、Ki67陽性表達(dá)患者1年生存率均低于陰性表達(dá)患者，進(jìn)一步提示臨床監(jiān)控DCLK1、Ki67水平對早期識別患者病情，控制預(yù)后具有積極作用。這與國內(nèi)其他研究相似[13，14]。

綜上所述，DCLK1、Ki67在結(jié)直腸癌疾病檢測中陽性表達(dá)率較高，與患者臨床病理關(guān)系密切，可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。