丁立波

摘要：通過使用當(dāng)?shù)匾椎玫霓r(nóng)副產(chǎn)品替代搖瓶培養(yǎng)基中的低溫黃豆餅粉，接種后培養(yǎng)檢測(cè)發(fā)酵最終的效價(jià)，在亞麻粕、高粱蛋白粉、葵粕中優(yōu)選出葵粕具有替代的可行性。結(jié)果表明在發(fā)酵生產(chǎn)中使用有機(jī)氮源葵粕按0.95：1比例替代配方中的低溫黃豆餅粉，可提高林可霉素A效價(jià)2.2%，原材料成本每月可節(jié)約50.7萬元。尤其可大幅提高最終成品質(zhì)量，發(fā)酵液中降低雜質(zhì)林可霉素B效價(jià)24.1%。

關(guān)鍵詞：林可霉素、培養(yǎng)基、有機(jī)氮源

林可霉素為林可酰胺類抗生素，是由林可酰胺（Lincosamide，LSM）和丙基輔氨酸（Propylproline，PPL）兩部分縮合后修飾而成，丙基輔氨酸是由L-酪氨酸合成而來[1]。實(shí)際生產(chǎn)中也需要使用大量的低溫黃豆餅粉補(bǔ)加，來補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)過程中的有機(jī)氮源，供菌體生長及產(chǎn)抗利用。通過使用本地較豐富、價(jià)格低廉的高粱蛋白粉、亞麻籽粉、葵粕按照粗蛋白含量等量換算替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的低溫黃豆餅粉從理論上是可行的。

1.材料與方法

1.1.菌種

林可霉素生產(chǎn)菌林肯鏈霉菌（菌LK20-14）由寧夏泰益欣生物科技有限公司菌種中心提供。

1.2.培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（%，W/V）：低溫黃豆餅粉0.62，淀粉2.1，KNO32，NaCl0.06，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O0.06，F(xiàn)eSO4·7H2O0.002，pH7.0～7.5;

2）搖瓶種子培養(yǎng)基（%，W/V）：低溫黃豆餅粉2，淀粉2.1，葡萄糖1.1，（NH4）2SO40.2，CaCO30.5，pH7.0;

3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基（%，W/V）：低溫黃豆餅粉3.1，葡萄糖10.5，玉米漿0.32、（NH4）2SO40.82，NaCl0.60，K2HPO40.02，NaNO30.82，CaCO30.81，pH7.0，

1.3.實(shí)驗(yàn)方法

1）斜面培養(yǎng)：玻璃棒沾取菌懸液，在斜面培養(yǎng)基涂抹均勻，培養(yǎng)溫度29～31℃，相對(duì)濕度16%～24%的環(huán)境下倒置，培養(yǎng)7～8d。

2）搖瓶種子培養(yǎng)：從斜面挑取單菌落接種搖瓶，培養(yǎng)基裝量30mL/300mL三角瓶，培養(yǎng)溫度29～31℃，相對(duì)濕度15%～25%，搖床轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)48～52h。

3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：待種子到培養(yǎng)周期后，將種子接入發(fā)酵搖瓶，培養(yǎng)基裝量35mL/300mL三角瓶，培養(yǎng)溫度29～31℃，相對(duì)濕度15%～25%，搖床轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)72h。

4）放大培養(yǎng)：150kL機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，29.5～30.5℃、罐壓0.025～0.035MPa、接種量40%培養(yǎng)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.低溫黃豆餅粉替代物的優(yōu)化選擇

低溫黃豆餅粉為有機(jī)氮源，含有豐富的粗蛋白、有機(jī)磷，本次實(shí)驗(yàn)選用的三種替代物料依據(jù)粗蛋白含量計(jì)算替代物使用量，其中高粱蛋白粉、葵粕（浸提）按1：1量替代，亞麻粕1.3：1替代相應(yīng)比例的低溫黃豆餅粉。綜合發(fā)酵單位及成本，葵粕（浸提）市場(chǎng)供應(yīng)充足、價(jià)格低廉、替代后發(fā)酵單位林可霉素A組分較好。選定葵粕（浸提）為最佳低溫黃豆餅粉替代原材料。

2.2.葵粕最佳替代比例確定

由粗蛋白含量確定替代比例，但某些氨基酸及維生素含量差異需要實(shí)驗(yàn)不同比例替代對(duì)發(fā)酵單位的影響，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證全部替代低溫黃豆餅粉所需的葵粕量，由下圖可以看出，當(dāng)葵粕的替代比例為0.95：1時(shí)，發(fā)酵單位可達(dá)到最高，觀察搖瓶菌絲形態(tài)及發(fā)酵液離心濕重均正常。確定最佳替代比例葵粕：低溫黃豆餅粉為0.95：1。

2.3.150kL發(fā)酵罐大生產(chǎn)放大實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果在發(fā)酵大生產(chǎn)中的效果，依據(jù)搖瓶替代比例，在發(fā)酵生產(chǎn)中按0.95：1使用葵粕替代四級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的低溫黃豆餅粉，連續(xù)進(jìn)十批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

從表4可以看出，替代后的平均發(fā)酵單位A組分效價(jià)較未替代前的平均單位高2.2%，使用葵粕較低溫黃豆餅粉價(jià)格成本低，月可為車間節(jié)約50.7萬元。產(chǎn)品質(zhì)量有較大提升，其中B組分效價(jià)替代后有較大幅度下降，發(fā)酵放罐B組分下降24.1%。

3.討論

由表1葵粕的粗蛋白含量與低溫黃豆餅粉含量相同，通過粗蛋白含量等量換算可以有效替代有機(jī)氮源，因其中氨基酸和其他物質(zhì)含量的不同，對(duì)林可霉素發(fā)酵單位有不同影響，需要適當(dāng)調(diào)整替代比例，最佳替代比例為0.95：1。

林可霉素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸作為甲基供體，在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的催化下，蛋氨酸與ATP作用，生成S腺苷蛋氨酸（SAM）。SAM中的甲基十分活潑，稱活性甲基，SAM稱活性蛋氨酸。SAM在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，可將甲基轉(zhuǎn)移給另一物質(zhì)，使甲基化[3][4]。葵粕蛋氨酸及膽堿含量相對(duì)低溫黃豆餅粉較高，為林可霉素A生物合成中三個(gè)甲基化步驟提供了較多的甲基供體。本次使用葵粕替代即降低了發(fā)酵罐培養(yǎng)基的物料成本，又降低了雜質(zhì)組分林可霉素B的含量。

參考文獻(xiàn)

[1]劉瑞華.林可霉素生物合成的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2018，45（05）：1138-1145.

[2]中國飼料數(shù)據(jù)庫.FeedStuff（2017）常規(guī)飼料成分[EB/OL].http：//www.chinafeeddata.org.cn/picture/pdf/CFICout2017_1.pdf

[3]Ushimaru R，Lin CI，Sasaki E，et al.Characterization of enzymes catalyzing transformations of cysteine S-conjugated intermediates in the lincosamidebiosynthetic pathway[J].ChemBioChem，2016，17（17）：1606-1611

[4]Hou BB，Lin YW，Wu HZ，et al.The novel transcriptional regulator lmbU promotes lincomycin biosynthesis through regulating expression of its target genes in Streptomyces lincolnensis[J].Journal of Bacteriology，2018，200（2）：e00447-17