潘中武，桂琳，胡霞，章琴，周書林

1.皖南醫(yī)學院醫(yī)學微生物與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校解剖學教研室；3.皖南醫(yī)學院醫(yī)學寄生蟲學教研室

湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)簡稱釘螺，為兩棲淡水生物，是日本血吸蟲的唯一中間宿主。釘螺分布范圍廣，孳生環(huán)境復雜，其分布與溫度等環(huán)境因素相關，溫度可以影響釘螺體內多種酶的活性[1]。既往研究表明，釘螺體內存在細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)[2]。COX為線粒體標志性酶，是生物氧化呼吸鏈中的末端酶，線粒體借助該酶將電子傳遞給氧，進而獲得能量，為細胞代謝提供必要的ATP來源；SDH是動物有氧氧化過程中三羧酸循環(huán)的關鍵酶，是線粒體能量代謝、糖的有氧氧化的重要標志酶，其活性與生殖細胞的發(fā)生及發(fā)育等生命活動相關。既往研究發(fā)現，多種化學物質(如滅螺藥)均可影響釘螺體內COX和SDH等多種酶活力[3-4]；在實驗室條件下模擬春季外界氣候變化，釘螺體內COX和SDH等酶活力也發(fā)生相應的變化[5]。

本研究在實驗環(huán)境中，觀察湖北釘螺在高溫和低溫脅迫作用下，釘螺軟體組織中COX和SDH含量變化情況，以期豐富溫度對釘螺影響的研究，為進一步控制釘螺提供參考。

1 材料與方法

1.1釘螺來源 于2019年3—5月采集湖北釘螺，采集地點為安徽省蕪湖市灣沚區(qū)青弋江支流趙家河段有螺江灘，經逸蚴法判定為陰性釘螺，選取有7～8個螺旋、活力較強的成螺在實驗室用去離子水馴養(yǎng)兩周后備用。

1.2主要儀器和試劑 手持均質器(SFJ-10)購自力辰科技股份有限公司，多功能酶標儀(Infinite 200pro)購自帝肯貿易有限公司。細胞色素氧化酶(COX)和琥珀酸脫氫酶(SDH)ELISA檢測試劑盒均購自貝克曼庫爾特公司，4 ℃保存。

1.3釘螺分組及處理 將實驗室馴養(yǎng)的釘螺隨機分成3組，分別為低溫脅迫組(下稱低溫組)、對照組、高溫脅迫組(下稱高溫組)，每組40只，每組均設3個平行組。將釘螺放置在培養(yǎng)皿內，所有培養(yǎng)皿均先放置一層海綿，上面再覆蓋一層粗草紙，在實驗過程中培養(yǎng)皿中均始終保持一定的濕度(培養(yǎng)皿中積水不超過草紙面)。高溫組和低溫組分別放在37 ℃和4 ℃搖床中，對照組直接放在20 ℃的實驗準備室內，24 h后將釘螺放置在-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.4COX和SDH含量的測定 將釘螺從-80 ℃冰箱中取出后立即解凍，用鑷鉗十字交叉法[6]碾壓釘螺后，在體視顯微鏡下剔除螺殼，取出軟體組織置于EP管中備用。取0.10 g軟體組織，加入1 mL生理鹽水，冰上勻漿，3 000 r/min離心30 min(離心半徑為7.25 cm)取上清液備用。按ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。繪制標準曲線，計算標準曲線方程，再將樣品測出的OD值代入方程，分別計算釘螺COX和SDH含量(按說明書步驟操作，樣品已被稀釋5倍，故最終結果乘以5才是樣本的實際濃度)。

2 結 果

2.1釘螺COX含量 COX標準曲線方程為y=0.222 2+0.013 6x-0.000 02x2，R2=0.995 0。對照組釘螺COX含量為(27.11±2.31)U/L，低溫組和高溫組分別為(21.90±0.32)U/L和(21.42±1.84)U/L，三組間不全相同，且差異有統(tǒng)計學意義(F=10.145，P<0.05)。與對照組相比，低溫組和高溫組釘螺COX含量均下降，且差異都具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2釘螺SDH含量 SDH標準曲線方程為y=0.008 5+0.157 1x-0.002 6x2，R2=0.998 3。對照組釘螺SDH含量為(1.30±0.002)U/L，低溫組和高溫組分別為(1.24±0.05)U/L和(1.12±0.02)U/L，三組間不全相同，且差異有統(tǒng)計學意義(F=124.624，P<0.05)。與對照組相比，低溫組和高溫組釘螺SDH含量均下降，其中高溫組下降更為明顯，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

3 討 論

脅迫原本用于逆境生理學的研究中，是生物所處的不利環(huán)境的總稱。不同學者對脅迫均有不同的理解，其基本內涵是指對生物生存與發(fā)育不利的各種外界環(huán)境因子(包括生物因素與非生物因素)的總和[7]。環(huán)境因子中溫度是一種可以對動物產生重要影響的生態(tài)因子，在適當的范圍內，動物可以進行正常的生理活動，而超出這個范圍就會引起生理活動異常，超出的范圍過大就會導致動物死亡[8]。溫度或溫度與其他環(huán)境因子共同作用可以影響動物的生長、發(fā)育、繁殖及代謝等生理活動[9]。

線粒體是產生ATP以及細胞呼吸的部位，與呼吸相關的酶主要有COX、SDH、NADH 等[10]。COX是線粒體呼吸鏈中電子傳遞過程的終末復合物，是線粒體進行氧化磷酸化的關鍵酶，也是線粒體標志酶[11]，COX在釘螺體內分布廣泛[1]。SDH屬于膜結合酶，存在于所有的有氧呼吸細胞中，能與線粒體膜牢固結合，屬于脫氫酶中最重要的酶[11]，SDH廣泛存在于釘螺軟體組織中[1]。因此COX和SDH的活性可在一定程度上反映有氧代謝的水平。研究溫度脅迫狀態(tài)下釘螺軟體組織中COX和SDH活性的變化，對于揭示釘螺所需能量與溫度之間的關系以及代謝水平均有重要的意義。

戴超[12]研究了溫度對三疣梭子蟹呼吸代謝酶的影響，陸君[13]等研究了低溫對擬穴青蟹抗氧化酶活性的影響，連春盎[14]研究了干露脅迫對脊尾白蝦呼吸代謝相關酶COX的影響，以上研究均發(fā)現外界溫度的改變對動物體內各種呼吸代謝酶會產生一定程度的影響。釘螺的最適宜生存溫度為20～26 ℃，本研究發(fā)現在非適宜溫度條件下，釘螺體內兩種呼吸酶含量均有改變。低溫或者高溫脅迫狀態(tài)下釘螺體內琥珀酸脫氫酶含量下降，這與趙偉民、宋志明等[15-16]研究的溫度對白條錦蛇和點籃子魚幼魚SDH活性影響結果一致。低溫或高溫脅迫狀態(tài)下釘螺體內細胞色素氧化酶含量同樣也下降，這一結果與路允良[17]研究的溫度對三疣梭子蟹代謝酶COX的影響結果一致。

變溫動物最重要的生物學特征之一是其體溫隨著環(huán)境溫度的改變而發(fā)生相應的變化，而動物的體溫又直接影響著動物體內酶的活性并最終決定其新陳代謝的水平，影響各種組織器官執(zhí)行相應的生物學功能[18]。當環(huán)境溫度在適當的范圍內發(fā)生改變時，變溫動物通過體內生化體系的多種重構途徑以消除或部分消除溫度變化對機體造成的影響，從而維持生物體正常的新陳代謝活動。但當環(huán)境溫度變化的幅度超過一定的范圍，如冬季或夏季，部分變溫動物會逐漸適應這種溫度變化，不斷降低新陳代謝水平直至進入休眠狀態(tài)(冬眠或夏蟄)。本研究結果表明，在溫度脅迫狀態(tài)下釘螺兩種呼吸酶的活性均表現為下降，可能是通過抑制線粒體代謝，使有氧呼吸提供的能量減少，從而降低物質和能量消耗來對抗溫度脅迫，但釘螺對溫度脅迫的耐受程度及具體機制尚需進一步探索。