陳靜思，林甲進(jìn)，張瑛，游維，江明華

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.輸血科；2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心

AB0血型系統(tǒng)是輸血醫(yī)學(xué)中最具重要臨床意義的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，血型的準(zhǔn)確鑒定在臨床輸血、法醫(yī)學(xué)、器官移植、親子鑒定中具有重要作用。B(A)亞型是一種罕見(jiàn)的ABO表型，是B等位基因發(fā)生突變導(dǎo)致，在血清學(xué)表現(xiàn)上既有B抗原的特點(diǎn)，又有A抗原的特性，在血型鑒定時(shí)易誤判為B型或AB型，給臨床血型鑒定和臨床輸血造成一定的困難和安全風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。鑒于其血清學(xué)特征的特殊性，近年來(lái)引起臨床的廣泛關(guān)注[4-5]。現(xiàn)將我們積累的8例B(A)型標(biāo)本檢測(cè)的血清學(xué)特征及基因測(cè)序結(jié)果總結(jié)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2021年6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院的8例ABO血型正反定型不一致或抗原減弱的血樣，分別記為標(biāo)本1～8，其中男2例，女6例，年齡7～69歲，均無(wú)血緣關(guān)系。入選標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《ABO亞型的檢測(cè)》要求[6]，排除標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)本紅細(xì)胞與抗-A1凝集素反應(yīng)陽(yáng)性者。抽取外周靜脈EDTA抗凝血5 mL待檢。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 單克隆抗-A和抗-B、抗-A1凝集素、單克隆抗-H血型定型試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限公司）；A、B、O細(xì)胞由本科室制備；聚凝胺試劑（武漢貝索有限公司）；基因組DNA試劑盒、人類紅細(xì)胞ABO血型-B(A)基因分型試劑盒（天津秀鵬生物技術(shù)有限公司）。ID-Centrifuge-12S II型離心機(jī)；ID-Incubator-37SI型孵育器(瑞士達(dá)亞美有限公司)；PCR擴(kuò)增儀；3730基因測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法：采用單克隆抗-A、抗-B、抗-H、抗-A1凝集素、ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞采用試管凝集法進(jìn)行血型檢測(cè)；采用聚凝胺交叉配血法，將標(biāo)本與A型、B型、AB型、O型供血者分別進(jìn)行交叉配血，標(biāo)明主次側(cè)，主側(cè)為患者標(biāo)本血漿100 μL及供者2%～5%紅細(xì)胞懸液50 μL，次側(cè)為供血者血漿100 μL及2%～5%標(biāo)本紅細(xì)胞懸液；采用序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction sequencespecific primer PCR-SSP）法進(jìn)行基因分型；采用Sanger直接測(cè)序法進(jìn)行基因測(cè)序。嚴(yán)格按照儀器試劑說(shuō)明書及測(cè)序方法步驟。

1.3.2 ABO血型基因分型和測(cè)序：采用磁珠法提取DNA，用人類紅細(xì)胞ABO血型/B(A)亞型基因分型試劑盒（PCR-SSP法），按照說(shuō)明書操作；采用Sanger測(cè)序法將產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行直接測(cè)序；使用chromespro軟件及DNAMAN8.0軟件將測(cè)序公司提供的abo序列與ABO基因參考序列（NG_006669.1）進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)dbRBC數(shù)據(jù)庫(kù)以及ISBT數(shù)據(jù)庫(kù)[Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023]確定基因型。

ABO基因分型、測(cè)序分析，在天津秀鵬生物技術(shù)有限公司協(xié)助下完成。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)和基因型檢測(cè)結(jié)果 8例標(biāo)本紅細(xì)胞與抗-A反應(yīng)呈1+至2+，與抗-A1反應(yīng)呈陰性，與抗-B反應(yīng)呈3+至4+，與抗-H反應(yīng)呈3+至4+，血清與Ac反應(yīng)呈2+至4+，與Bc、Oc、自身細(xì)胞均不反應(yīng)；8例樣本經(jīng)PCR-SSP法檢測(cè)ABO基因分型為B(A)亞型。8例標(biāo)本血清學(xué)和基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8例標(biāo)本血清學(xué)和基因型檢測(cè)結(jié)果

2.2 基因測(cè)序 8例標(biāo)本直接測(cè)序結(jié)果：標(biāo)本1、3、4、5、7的第六外顯子為c.261delG和c.297A＞G，第七外顯子為c.526 C＞G、c.640A＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C、c.930 G＞A雜 合；標(biāo)本2、6、8的第六外顯子為c.261delG和c.297A＞G，第七外顯子為c.526 C＞G、c.657 C＞/T、 c.700 C＞G、c.703 G＞A、c.796 C＞A、c.803 G＞ C、c.930 G＞A雜合（見(jiàn)圖1、圖2、圖3）。

圖1 B(A)04、B(A)02基因序列主要堿基替換位點(diǎn)

圖2 B(A)04基因測(cè)序c.640 A＞G雜合錯(cuò)義突變

圖3 B(A)02基因測(cè)序c.700C＞G雜合錯(cuò)義突變

2.3 交叉配血 8例樣本主側(cè)與A型、AB型供血者紅細(xì)胞懸液凝集反應(yīng)陽(yáng)性，與B型、O型供血者紅細(xì)胞懸液凝集反應(yīng)陰性；次側(cè)與A型、B型、O型供血者血漿凝集反應(yīng)陽(yáng)性，與AB型供血者血漿凝集反應(yīng)陰性。8例樣本與A型、B型、AB型、O型供血者交叉配血結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 8例樣本與A型、B型、AB型、O型供血者交叉配血結(jié)果

3 討論

正常A型、B型、AB型等位基因分別位于第9號(hào)同源染色體的ABO位點(diǎn)上，從父親或母親遺傳而來(lái)，但極少數(shù)人1條9號(hào)染色體上存在1個(gè)B(A)基因，其編碼酶具有雙功能活性，除催化A抗原、B抗原的合成，還具有表現(xiàn)出AB型的特征，稱為B(A)血型。B(A)抗原形成機(jī)制還沒(méi)有完全闡明，認(rèn)為B(A)基因產(chǎn)物既能合成大量尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal、B抗原糖供體），又能合成少量尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺（UDP-GalNAC、A抗原糖供體）到H抗原表面，形成其主要特征。B(A)型的表現(xiàn)頻率極低，國(guó)內(nèi)獻(xiàn)血人群、國(guó)外歐洲人群分別報(bào)道在1/5萬(wàn)～1/10萬(wàn)、1/17萬(wàn)～1/58萬(wàn)[7]，文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)漢族B(A)型等位基因分布在北方和南方基本相似，B(A).04為1.6/10萬(wàn)人，B(A).02為0.78/10萬(wàn)人[8]。YAMAMOTO等[9]首先發(fā)現(xiàn)由遺傳學(xué)上的B型紅細(xì)胞表達(dá)弱的A抗原為特征的常染色體控制表型，具有順式遺傳方式。1993年，第1次發(fā)現(xiàn)了既能編碼正常B糖基轉(zhuǎn)移酶又具有A糖基轉(zhuǎn)移酶活性的B等位基因，這個(gè)等位基因后被命名為B(A).01。目前已報(bào)道有7種B(A)等位基因，分別為B(A).01、B(A).02、B(A).03、B(A).04、B(A).05、B(A).06，B(A).07[10-11]。國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的B(A)亞型以個(gè)案報(bào)道和家系為主，等位基因有5種：B(A).02、B(A).04、B(A).05、B(A).06、B(A).07，以B(A).04、B(A).02多見(jiàn)[12-13]。本研究8例標(biāo)本采用PCR-SSP法對(duì)其進(jìn)行基因分型，確定其基因型B(A).04/O.01.02 2例、B(A).02/O.01.02 2例、B(A).04/O.01.01 2例、B(A).04/A.01.01 1例、B(A).02/O.01.01 1例，以B(A).04、B(A).02為主。

基因測(cè)序分析是鑒定疑難血型的重要手段。有研究報(bào)道[14]，B(A)亞型主要的血清學(xué)特點(diǎn)是其紅細(xì)胞與抗-B呈現(xiàn)正常凝集強(qiáng)度、與高效價(jià)單克隆抗- A具有明顯反應(yīng)、與人源性抗-A或經(jīng)過(guò)一定比例稀釋的單克隆抗-A在室溫中不反應(yīng)、與單克隆抗-H反應(yīng)凝集強(qiáng)度3～4+，反定型結(jié)果與正常B型反應(yīng)結(jié)果一致。本研究8例樣本的紅細(xì)胞與單克隆抗-A呈低度凝集強(qiáng)度、與單克隆抗-B呈正常凝集強(qiáng)度、與抗-A1凝集素不反應(yīng)、與單克隆抗-H反應(yīng)強(qiáng)度接近O型，正定型結(jié)果表現(xiàn)為A弱B特征，呈現(xiàn)“A弱B強(qiáng)”，反定型結(jié)果表現(xiàn)為B型特征；其血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，至于B(A)亞型紅細(xì)胞是否存在冷反應(yīng)A抗原及其血清學(xué)異質(zhì)性差異，有待于后續(xù)留取該類樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)探討。目前B(A)基因突變有c.700 C＞G、c.640 A＞G和c.641T＞C，分別由YU等[15]于1999年、郭忠慧等[16-17]于2004年和2006年首先報(bào)道。本研究通過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)B(A).04與B101/O01序列比對(duì)，在640位核苷酸發(fā)生A＞G單堿基突變，導(dǎo)致第214位甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸；B(A).02與B101/O02序列比對(duì)，在700位核苷酸發(fā)生C＞G單堿基突變，導(dǎo)致第234位脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，與上述報(bào)道一致。本研究中，將罕見(jiàn)的B(A)亞型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果和基因序列分析相結(jié)合，為患者血型鑒定和后續(xù)臨床輸血提供安全保障。

目前針對(duì)B(A)亞型患者的臨床用血尚無(wú)統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過(guò)交叉配血實(shí)驗(yàn)表明，B(A)型血型無(wú)論被鑒定是AB型還是B型，即輸注AB型懸浮紅細(xì)胞或B型的血漿均有產(chǎn)生嚴(yán)重溶血反應(yīng)的可能；鑒于B(A)亞型發(fā)現(xiàn)的稀有特征，以致B(A)血型的供血者極少，在臨床上難以滿足同型輸血，基本采用自體或相容性輸注的原則，對(duì)B(A)型患者采用自體備血或輸注洗滌B型、O型紅細(xì)胞或輸注AB型非紅細(xì)胞血液制品。同時(shí)在臨床輸血前，當(dāng)正定型和反定型出現(xiàn)不相符時(shí)，需要結(jié)合血型血清學(xué)、家系成員及采用分子生物學(xué)技術(shù)方法來(lái)正確鑒定和判定血型，避免漏檢ABO亞型，確保后續(xù)臨床安全輸血。