宮 平 徐志卿,2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100069； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

北京時間2021年9月25日，拉斯克獎(the Lasker Awards)公布了2021年度獲獎?wù)呙麊巍?/p>

1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎

2021年基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎頒發(fā)給了3位在光遺傳學(xué)(optogenetics)領(lǐng)域貢獻突出的科學(xué)家,他們是德國馬克斯普朗克生物化學(xué)研究所(Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried)的Dieter Oesterhelt(圖1)、柏林洪堡大學(xué)(Humboldt University of Berlin)的Peter Hegemann(圖2)和斯坦福大學(xué)(Stanford University)的Karl Deisseroth(圖3)。拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎素有“美國的諾貝爾獎”和“諾貝爾獎風(fēng)向標(biāo)”之美譽。光遺傳學(xué)技術(shù)作為一項神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的革命性新技術(shù)，目前已被全世界數(shù)千個實驗室應(yīng)用于解析神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。與此同時，它也為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。

圖1 Dieter Oesterhelt[1]

圖2 Peter Hegemann[1]

圖3 Karl Deisseroth[1]

2 光遺傳學(xué)的發(fā)展歷程

哺乳動物的大腦是一種復(fù)雜又精密的系統(tǒng)，大腦中約有數(shù)百億的神經(jīng)元相互連接，這些神經(jīng)元分別具有不同的特性和“布線”模式，相互纏繞的神經(jīng)元能夠精確地交換毫秒級別的電信號，從而產(chǎn)生記憶、思考、感覺和情緒等多種生理活動[2]。我們熟知的神經(jīng)系統(tǒng)疾病都與腦內(nèi)神經(jīng)元的功能密切相關(guān)。

多年以來，神經(jīng)生物學(xué)家專注于解析神經(jīng)元的具體功能。但研究手段存在局限性，無法特異性地操控某類神經(jīng)元的活動。諾貝爾獎獲得者Francis Crick在1979年曾提出“神經(jīng)科學(xué)面臨的挑戰(zhàn)是如何去操控大腦中某一類神經(jīng)元，同時不改變其他神經(jīng)元的生理功能”?？茖W(xué)家對此目標(biāo)也嘗試了許多種解決方法：如試圖使用藥物操控，這種方法雖然可以特異性地操控某類神經(jīng)元，但由于很難做到毫秒級別，缺乏時間精度；也曾試圖用電刺激某一類神經(jīng)元，但因為電極的控制精度有限，往往對電極插入部位的所有神經(jīng)元同時產(chǎn)生刺激作用，缺乏對目標(biāo)神經(jīng)元的選擇性，且電刺激只能促進神經(jīng)元放電，卻不能抑制其放電。因此這些方法都具有一定的缺陷性，并不能做到精細化操控神經(jīng)元。雖然Crick也推測“也許光線可以作為控制工具操控神經(jīng)元”，但當(dāng)時的科學(xué)家不知道如何讓神經(jīng)元對光線做出反應(yīng)。

2.1 光敏蛋白的發(fā)現(xiàn)

1969年，年輕的生物化學(xué)家Dieter Oesterhelt從德國慕尼黑大學(xué)博士畢業(yè)之后，來到了美國加州大學(xué)舊金山分校，從那里開啟了對細菌視紫紅質(zhì)的研究。1971年，他和生理學(xué)家Walther Stoeckenius在細菌的細胞膜中，發(fā)現(xiàn)了一種紫紅色物質(zhì)含有視黃醛，因此將其命名為細菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin，BR)[3]。細菌視紫紅質(zhì)能夠起到光傳感器或光感受器的作用，當(dāng)光照時能夠吸取光子的能量，將質(zhì)子泵出細胞。隨著研究的深入，研究人員證明了細菌視紫紅質(zhì)為一種光控的氫離子通道。這種微生物蛋白質(zhì)與脊椎動物的蛋白質(zhì)不同，它不與細胞內(nèi)的第二信使發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，間接影響離子通道，而是直接將光子轉(zhuǎn)成電流?？茖W(xué)家隨后對這種蛋白質(zhì)家族的其他成員展開研究。在1977年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了主要介導(dǎo)氯離子細胞內(nèi)流的鹵視紫紅質(zhì)(halorhodopsin，HR)[4](圖4)。而2002年發(fā)現(xiàn)了這個蛋白質(zhì)家族的另外一個成員視紫紅質(zhì)通道蛋白(channelrhodopsin，ChR)，開啟了光遺傳學(xué)時代。

圖4 微生物中發(fā)現(xiàn)的3種光敏蛋白[6]

視紫紅質(zhì)通道蛋白的發(fā)現(xiàn)，其靈感最早來源于另一種光敏感微生物——綠藻(Chlamydomonas)。從1986年開始，Dieter Oesterhelt的博士學(xué)生——生物物理學(xué)家Peter Hegemann就開始以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為材料，對其趨光性進行研究?？茖W(xué)研究的過程并不順利，直至2001年，Peter Hegemann才通過比對綠藻基因組數(shù)據(jù)庫，找出了兩個與細菌視紫紅質(zhì)高度同源的候選基因。2003年，通過將候選基因分別轉(zhuǎn)入動物細胞(非洲爪蟾蜍的卵母細胞)[5]和人的細胞(人胚胎腎臟細胞HEK293)[6]中，均準(zhǔn)確表達了衣藻視紫紅質(zhì)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白的活性受光的調(diào)控，并且介導(dǎo)了陽離子如鈉離子、鈣離子等流入細胞中，這也是第一次發(fā)現(xiàn)光能夠直接控制離子通道。這種蛋白的發(fā)現(xiàn)，也給了神經(jīng)生物學(xué)家?guī)砹诵碌乃悸罚篊hR可以在神經(jīng)元中表達并影響其生理功能，它也許可以成為光控制神經(jīng)元的理想介質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)奠定了光遺傳學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)。

2.2 光遺傳學(xué)的誕生

ChR的發(fā)現(xiàn)吸引了眾多神經(jīng)生物學(xué)家的目光，越來越多的研究者加入到光控細胞的探索中。起初，研究者[7-8]認為這種異物膜蛋白可能會對哺乳動物的神經(jīng)元有毒不良反應(yīng)，其光電流(photocurrent)可能會過慢或過弱，無法發(fā)揮預(yù)想的作用。且微生物的視蛋白吸收光子時需要輔助因子全反式視黃醛的配合，因此有些研究者認為其可能難以獨立發(fā)揮作用。此時，斯坦福大學(xué)的Edward. S. Boyden和Karl Deisseroth也在探索控制神經(jīng)元的新技術(shù)，尤其是當(dāng)過精神科醫(yī)生的Karl Deisseroth迫切地想要找到一種對精神病患者不良反應(yīng)小的新的治療方法。直到2005年8月，擁有工程背景的Edward. S. Boyden和醫(yī)學(xué)背景的Karl Deisseroth使用慢病毒載體將單個ChR2基因轉(zhuǎn)入哺乳動物的神經(jīng)元后，ChR2能夠準(zhǔn)確地表達在海馬神經(jīng)元的細胞膜上，且在不添加全反式視黃醛的條件下，藍光照射表達外源性ChR2的神經(jīng)元可以在50 ms內(nèi)引起陽離子的流入，神經(jīng)元發(fā)生去極化效應(yīng)，即神經(jīng)元能夠準(zhǔn)確地對光做出反應(yīng)[9]。這一新穎的發(fā)現(xiàn)雖然當(dāng)時被Science雜志拒稿，只刊登在NatureNeuroscience上，但它卻正式拉開了光遺傳學(xué)的序幕。后來，人們證實BR和HR也能夠快速又準(zhǔn)確地開啟或終止神經(jīng)元的活動[10]。除了上述提到的科學(xué)家，華人視覺科學(xué)家潘卓華(美國韋恩州立大學(xué))，也提出了光敏蛋白ChR2在視網(wǎng)膜細胞上的表達，這一發(fā)現(xiàn)對治療失明有很大的臨床應(yīng)用價值[11]。同期，Lynn T. Landmesser、Stefan Herlitze(美國凱斯西儲大學(xué))和Hiromu Yawo(東京大學(xué)生命科學(xué)研究院)也分別發(fā)表了ChR2在哺乳動物細胞和神經(jīng)細胞中的應(yīng)用研究[12-13]。

3 光遺傳學(xué)的基本原理

神經(jīng)元在靜息狀態(tài)下，細胞膜兩側(cè)存在電位差，這是由于細胞膜內(nèi)外各種離子濃度分布不均勻和細胞膜對各種離子的通透性不同所造成的。而細胞膜對各種離子的通透性的改變會導(dǎo)致膜電位的改變進而導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性發(fā)生改變。光遺傳學(xué)的原理是選用病毒載體，將光敏蛋白的基因轉(zhuǎn)入到特定的神經(jīng)細胞中，目的是為了表達光敏的離子通道[14]。當(dāng)這些能被不同波長的光激活的光敏蛋白受到相應(yīng)波長的光照刺激時，這些離子通道會對細胞膜內(nèi)外的陽離子或陰離子產(chǎn)生選擇性開放，引起細胞膜內(nèi)外的膜電位發(fā)生改變，從而選擇性地興奮或抑制神經(jīng)細胞(圖5)。

圖5 光遺傳學(xué)的工作原理[13]

光遺傳學(xué)是將遺傳學(xué)和光學(xué)結(jié)合在一起的新興技術(shù)[15]。它通過將具有光反應(yīng)性的基因插入特定的神經(jīng)細胞中，用光來控制經(jīng)過基因改造的目標(biāo)細胞，以此來精準(zhǔn)操控目標(biāo)細胞來確定如其在活體神經(jīng)回路中的作用等。由于哺乳動物的組織中天生就含有足量的全反式視黃醛，除了轉(zhuǎn)入ChR基因，無需再向目標(biāo)神經(jīng)元中轉(zhuǎn)入其他基因。因此，光遺傳學(xué)具有高度可行性和應(yīng)用性[16-17]。

在應(yīng)用過程中，首先要選擇適合的光敏蛋白。光敏蛋白按功能分類，可分為兩類，即激活神經(jīng)元型，如：ChR2(H134R)、ChR2(C128S/D156A)、ChETA、oChIEF、C1V1、Chronos、ChrimsonR、ST-ChroME和ChRger等；和抑制神經(jīng)元型，如eNpHR3.0、Arch、Mac、Jaws和ST-eGtACR1等。第二，將光敏蛋白導(dǎo)入靶細胞中，常用方法包括轉(zhuǎn)染、病毒注射或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物等。第三，將光導(dǎo)入研究的區(qū)域，如采用導(dǎo)入光纖或者控制激光來實現(xiàn)，通過選擇不同參數(shù)(波長、光強度、頻率)光照進行刺激，對神經(jīng)元進行精準(zhǔn)的時間和/或空間調(diào)控。第四，配合電生理記錄或行為學(xué)手段等實驗方法，觀察和記錄光刺激后的神經(jīng)元變化、神經(jīng)環(huán)路或動物的行為學(xué)變化。

4 光遺傳學(xué)的未來

隨著光遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，光遺傳學(xué)作為一項新的技術(shù)已被廣泛用于各領(lǐng)域科學(xué)研究中。在光遺傳學(xué)技術(shù)的幫助下，在阿爾茨海默病[18]、帕金森病[19]、抑郁癥[20]、慢性疼痛和焦慮[21]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中可以對神經(jīng)細胞進行精準(zhǔn)解析，從而對相關(guān)機制有更深層次的認識。光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也為神經(jīng)系統(tǒng)的藥物研發(fā)帶來了新的契機[22]，且人們也在不斷地探討光遺傳學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用，希望能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟新的途徑。此外，光遺傳學(xué)技術(shù)不但已經(jīng)被應(yīng)用于心血管[23]等其他系統(tǒng)的生理和病理機制研究，還被用于植物細胞功能的研究[24]。同時，人們也發(fā)現(xiàn)光遺傳學(xué)技術(shù)存在一些需要關(guān)注和改善的問題：如神經(jīng)元中的光敏蛋白的表達也許并不均勻，過表達的光敏蛋白本身對細胞功能的影響，等等。每項新的科學(xué)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的背后，都隱藏著許多勇于探索和創(chuàng)新的科學(xué)家，他們都值得我們敬佩。但我們相信，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，會有更多的交叉學(xué)科技術(shù)應(yīng)用于光遺傳學(xué)中，雖然也許還需要經(jīng)歷艱難和漫長的探索過程，但光遺傳學(xué)技術(shù)會逐步得到完善并被更廣泛地應(yīng)用。