孟金柱，安清明，吳震洋，趙園園

（銅仁學(xué)院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州銅仁 554300）

雌性動物的卵泡在胎兒發(fā)育過程中就已經(jīng)形成，最初由卵母細胞組成，在減數(shù)分裂中停止，逐步被多層上皮顆粒細胞（GCs）包圍[1]。卵泡膜在基底層外發(fā)育，內(nèi)膜由毛細血管、成纖維細胞、免疫細胞和類固醇生成細胞組成[2]，其中類固醇生成細胞負(fù)責(zé)分泌雄激素和胰島素樣因子3（INSL3），這個過程會持續(xù)到排卵[3]。GCs 只有在排卵前才發(fā)育成熟為類固醇生成細胞，將卵泡膜細胞（TCs）分泌的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素[4]。隨著卵泡液中雌激素濃度持續(xù)升高，促黃體素（LH）峰出現(xiàn)，誘發(fā)卵泡排卵。排卵后，卵巢上的TCs 和GCs 分別增殖分化形成小黃體細胞（SLCs）和大黃體細胞（LLCs），SLCs 中含有大量促黃體素受體（LHR），抑制黃體LH 的分泌，從而抑制排卵；而LLCs 則表達大量的前列腺素F2α受體（PTGFR），使黃體溶解，從而引起排卵發(fā)生[5-6]。

目前，人們對包括牛、羊及人類在內(nèi)的多種動物卵泡中GCs 和TCs 的生理作用進行了研究，物種之間雖然存在差異，但在卵巢生理學(xué)方面大部分是保守的[7]。Christenson 等[8]報道了牛GCs 和TCs 在LH 和前列腺素峰發(fā)生時的短期變化，但是從卵泡到黃體的轉(zhuǎn)變也沒有得到解決。本研究通過篩選GEO 數(shù)據(jù)庫GSE83524 RNA-seq 表達譜中SLCs 和GCs 之間的差異表達基因，應(yīng)用生物信息學(xué)分析結(jié)合qRT-PCR 驗證，為支持現(xiàn)有的黃體細胞分型及擴展這些細胞在卵巢生理中的功能作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 選取18 月齡健康的思南黃牛（母牛），屠宰后分別收集雙側(cè)卵巢上的最大卵泡（卵巢囊腫除外），參考文獻方法[9]來篩選優(yōu)勢卵泡并分離GCs，參考文獻方法[10]分離SLCs。本實驗所用5 頭牛的GCs 和SLCs 均為課題組前期從萬山肉牛屠宰場獲得并于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus 購自Invitrogen 公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TB Green?Fast qPCR Mix 購自TAKARA 公司。

1.3 芯片數(shù)據(jù)的獲取及差異表達基因篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫（http：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載基于GPL16500 平臺（Bovine Gene 1.0 ST Array）的GSE83524數(shù)據(jù)集，其中包含了4 頭牛優(yōu)勢卵泡中的GCs 樣本和3 頭牛的SLCs 樣本。使用R 語言軟件編程，設(shè)定閾值FPKM ≥2，|log2（差異倍數(shù)）| ≥1.5，校正后P＜0.01，獲得GCs 和SLCs 中的差異表達基因。

1.4 GO、KEGG 信號通路和PPI分析使用R語言軟件中g(shù)oseq 包對GCs 和SLCs 中的差異表達基因進行GO 功能富集分析，同時使用kobas 軟件對其進行KEGG 信號通路分析；最后使用String 結(jié)合Cytoscape軟件構(gòu)建差異表達蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）并篩選出連通度最大的10 個hub 基因。

1.5 總RNA 提取與RT-PCR 反應(yīng) 按照RNAiso Plus試劑使用說明操作方法，分別提取GCs 和SLCs 的總RNA，電泳、測量濃度合格后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 去除2 種細胞中的gDNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.6 引物設(shè)計與合成 利用NCBI 引物設(shè)計軟件，根據(jù)GeneBank 中提交的牛屬各目的基因和內(nèi)參基因（RPLP0）序列，設(shè)計引物（表1）并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.7 qRT-PCR 檢測 根據(jù)TB Green?Fast qPCR Mix 操作說明建立25 μL PCR 反應(yīng)體系：TB Green Fast qPCR Mix（2×）12.5 μL，模板cDNA（50 ng）2 μL，上下游引物（10μM）各1 μL，ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s，40 個循環(huán)。實驗設(shè)定樣本重復(fù)（n=3）和技術(shù)重復(fù)（n=5），采用2-ΔΔCT對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，計算各基因的相對表達量并利用SPSS17.0 軟件進行顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”來表示。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因的篩選 通過DESeq2 分析共獲得241 個差異表達基因，其中上調(diào)表達基因121 個，下調(diào)表達基因120 個，聚類分析熱圖直觀地表現(xiàn)出了差異表達基因在SLCs 與GCs 中的表達情況（圖1），表2 列出了其中差異倍數(shù)最高的15 個基因。

表2 差異倍數(shù)最高的15 個基因及其功能分析

圖1 差異表達基因分層聚類分析

2.2 差異表達基因GO 分析和KEGG 分析 通過對241個差異表達基因進行GO 分析，共產(chǎn)生了65 個具有顯著意義的條目，其中有31 組分布在生物學(xué)過程，血管生成、細胞增殖調(diào)節(jié)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控及凋亡過程富集最為集中；有20 組分布在細胞組分，主要富集在細胞核、細胞質(zhì)、細胞外間隙；有14 組富集到了分子功能，主要在以下功能富集，即ATP 結(jié)合、受體結(jié)合和蛋白激酶活性（圖2）。

圖2 差異表達基因GO 功能富集分析

2.3 差異表達基因KEGG 信號通路分析 KEGG 信號通路分析共獲得10 條通路，其中病毒致癌作用富集最為顯著（圖3）；而參與FoxO 信號通路的7 個基因（PLK4、CCND2、GADD45A、PLK2、STAT3、TNFSF10、TGFBR2）可能與卵巢上細胞的增殖、分化、生殖激素的分泌及卵泡發(fā)育密切相關(guān)。

圖3 差異表達基因KEGG 信號通路

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析 使用String 軟件構(gòu)建差異表達基因之間的PPI 網(wǎng)絡(luò)，探索其中的基礎(chǔ)關(guān)聯(lián)情況。利用Cytoscape 軟件對產(chǎn)生的PPI 互作數(shù)據(jù)進行可視化分析，按照最大團中心性（MCC）算法篩選出前10 位Hub 基因，分別是中心體關(guān)聯(lián)蛋白E（CENPE）、DLG 關(guān)聯(lián)蛋白5（DLGAP5）、驅(qū)動蛋白家族15（KIF15）、周期素依賴性蛋白激酶1（CDK1）、細胞周期蛋白A2（CCNA2）、驅(qū)動蛋白家族11（KIF11）、非SMC 凝聚復(fù)合體亞基G（NCAPG）、Xklp2 靶向蛋白（TPX2）、母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶（MELK）和PDZ 結(jié)合激酶（PBK）（圖4）。

2.5 qRT-PCR 驗證分析 隨機選取參與FoxO 信號通路的3 個基因（STAT3、TNFSF10、TGFBR2）及PPI 分析中連通度最大的3 個Hub 基因（CENPE、CDK1、MELK）進行qRT-PCR 驗證。結(jié)果顯示，6 個基因在SLCs 和GCs 中的表達趨勢與GEO 芯片數(shù)據(jù)一致（圖5）。

3 討論

雌性動物的卵泡為卵母細胞生長和成熟提供了必要的環(huán)境[11]。黃體是由排卵后的卵泡壁形成的一種內(nèi)分泌腺體，其內(nèi)部不但含有大量的類固醇生成細胞，而且還分布了廣泛的毛細血管網(wǎng)絡(luò)，為維持妊娠提供必要的孕酮[12]。牛、羊和人類黃體有2 種不同的類固醇生成細胞，它們產(chǎn)生孕酮的能力不同[13]。在分化過程中，細胞色素P450 家族11A1（CYP11A1）和3b-羥基甾體脫氫酶（HSD3B）在2 種黃體細胞中大量表達，將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯酮和孕酮[14]。在牛和人等大型哺乳動物中，GCs 起源于中腎表面的上皮細胞，并分化為卵丘細胞和卵泡壁GCs[15]。GCs 與其周圍細胞之間的信息交換決定了基因表達、激素分泌和細胞凋亡[16]。在大多數(shù)哺乳動物中，卵泡TCs 和GCs 都參與黃體的形成，并維持不同的功能和形態(tài)[17]，因此了解卵巢細胞的起源有助于全面了解卵泡的發(fā)育和黃體的形成。

類固醇激素在卵泡發(fā)育中具有重要作用，其通過改變下丘腦GnRH 的分泌或直接作用于垂體前葉促性腺激素分泌細胞來影響LH 和FSH 的產(chǎn)生[18]。在FSH 的誘導(dǎo)下，GCs 中細胞色素P450 19A1（CYP19A1）大量表達，將來自TCs 的雄激素轉(zhuǎn)化為E2，促進GCs 中FSH 受體和LH 受體的合成，使得CYP19A1 的活性增強，進一步加快了E2的分泌，從而使卵泡迅速生長[19]。本研究通過對GEO 數(shù)據(jù)庫GSE83524 RNA-seq 表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)參與FoxO 信號通路的7 個基因在卵巢生理功能中扮演了重要角色。使用String 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用Cytoscape 軟件對PPI 互作數(shù)據(jù)進行可視化分析，篩選出了10 個Hub 基因。隨機選取其中的6 個基因并通過qRT-PCR 進行驗證分析，結(jié)果顯示其在SLCs 和GCs 中的表達趨勢與GEO 芯片數(shù)據(jù)一致，證明這些基因可能與卵巢上細胞的增殖、分化、生殖激素的分泌及卵泡發(fā)育密切相關(guān)。

STAT3 是卵巢中重要的信號分子和轉(zhuǎn)錄激活因子，在GCs、TCs 和卵母細胞中都有表達，尤其是在排卵周期和體外成熟階段[20]。研究表明，STAT3 在GCs 中被表皮生長因子（EGF）激活，從其細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，在胚胎著床過程中起重要作用[21]。TNFSF10 在豬卵巢卵泡閉鎖期間與GCs 凋亡有關(guān)[22]，KULUS 等[23]也證實了TNFSF10 屬于與凋亡和細胞死亡相關(guān)的本體論群體。TGFBR2 在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，已被證實參與了排卵障礙的發(fā)病機制[24]。FoxO 是叉頭基因轉(zhuǎn)錄因子的一個亞家族，其成員包括FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6 等4 個，其通路在細胞代謝、分化、周期阻滯、凋亡及自噬等方面起著至關(guān)重要的作用[25]。大量研究表明，CENPF 的缺失導(dǎo)致G2/M 阻滯、染色體分離缺陷、有絲分裂延遲及細胞死亡[26-27]。Berisha等[28]研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A、FGF-2、IGF-1、IGF-2 和ANG等與血管生成、卵泡生長和黃體形成密切相關(guān)的因子在成熟卵泡和早期黃體（1～4 d）中的表達水平達到最高，之后處于一個較低的平臺期，然而本研究篩選出241 個差異表達基因卻沒有涵蓋，可能是由于這些基因在牛優(yōu)勢卵泡GCs 中的表達正好處于較低水平。本實驗通過KEGG 信號通路與PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO 信號通路中的7 個基因可能與顆粒細胞的增殖、卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體化密切相關(guān)；篩選出的10 個Hub 基因也同樣為支持現(xiàn)有的黃體細胞分型及擴展這些細胞在卵巢生理中的功能作用提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在牛卵巢SLCs 和GCs 中共獲得241 個差異表達基因，其中上調(diào)表達基因121 個，下調(diào)表達基因120 個。通過GO 功能富集分析、KEGG 信號通路分析及PPI 蛋白網(wǎng)路互作分析，篩選出17 個能與卵巢上細胞的增殖、分化、生殖激素的分泌及卵泡發(fā)育密切相關(guān)的基因。qRT-PCR 驗證結(jié)果顯示其在SLCs 和GCs 中的表達趨勢與GEO 芯片數(shù)據(jù)一致。綜上表明，這些基因可能參與了SLCs 和GCs 的增殖、分化、生殖激素的分泌，從而影響從卵泡到黃體的轉(zhuǎn)變，為深入研究細胞特異性及細胞分化機制提供參考。